[發(fā)明專(zhuān)利]一種殺蟲(chóng)球孢白僵菌工程菌構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911124752.8
• 申請(qǐng)日: 2019-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110669777B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李同祥;孫會(huì)剛;田林;湯薇;黃天姿;董玉瑋;李文;王春艷;高兆建;王陶
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 徐州工程學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/66
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/66;C12N15/80
• 代理公司: 南京瑞弘專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 張婷婷

本發(fā)明公開(kāi)了一種殺蟲(chóng)球孢白僵菌工程菌構(gòu)建方法，設(shè)計(jì)引物從pUC57?AaIT載體中PCR擴(kuò)增AaIT基因，經(jīng)酶切、純化和pbarGPEl構(gòu)建pbarGPEl?AaIT載體；用引物擴(kuò)增出GpdA?AaIT?TrpC表達(dá)盒；用Not1單酶切pGPS3Ben?bbchit1并去磷酸化，與用Not1酶切的GpdA?AaIT?TrpC連接，轉(zhuǎn)化篩選獲得pGPS3Ben?bbchit1?AaIT表達(dá)載體，將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落；球孢白僵菌孢子懸液和含pGPS3Ben?bbchit1?AaIT載體的根癌農(nóng)桿菌液混合，經(jīng)固體IM培養(yǎng)基、CPZ選擇培養(yǎng)基篩選獲得轉(zhuǎn)化球孢白僵菌工程菌株。本發(fā)明構(gòu)建的球孢白僵菌工程菌株可制備高效殺蟲(chóng)生物防治劑，對(duì)環(huán)境無(wú)污染且防治效果良好，適合在生物防治技術(shù)領(lǐng)域推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉微生物蟲(chóng)害防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種殺蟲(chóng)球孢白僵菌工程菌構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

真菌殺蟲(chóng)劑是以昆蟲(chóng)病原真菌為有效成分的生物農(nóng)藥，目前世界上已記載的殺蟲(chóng)真菌大約有100個(gè)屬，800多個(gè)種，其中約50％集中于半知菌亞門(mén)(Deuteromycotina)，主要分布在白僵菌屬((Beau?veria)、綠僵菌屬(Metarhizium)、擬青霉屬(Paecilomyces)、被毛孢屬(Hirsutella)、蟪霉屬(Nom?uraea)、輪枝霉屬(Verticillium)等。在中國(guó)、巴西、俄羅斯和歐美國(guó)家，真菌殺蟲(chóng)劑已廣泛用于農(nóng)林害蟲(chóng)和城市昆蟲(chóng)的防治。目前世界上已有60多個(gè)真菌殺蟲(chóng)劑產(chǎn)品問(wèn)世。同時(shí)與其它殺蟲(chóng)微生物相比，昆蟲(chóng)病原真菌具有主動(dòng)致病昆蟲(chóng)、擴(kuò)散效果好、土壤宿存能力較長(zhǎng)、寄主不易產(chǎn)生抗性和容易生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。因此，昆蟲(chóng)病原真菌在害蟲(chóng)防治已得到廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

昆蟲(chóng)病原真菌中，研究最多、應(yīng)用效果最好的是白僵菌(Beauveria?bassiana)。白僵菌的分布范圍很廣，從海拔幾米至2000多米的高山均有白僵菌的存在，白僵菌可以侵入6個(gè)目15科200多種昆蟲(chóng)、螨類(lèi)。與細(xì)菌、病毒等需要被昆蟲(chóng)取食到消化道后才能發(fā)揮毒殺作用機(jī)理不同，白僵菌經(jīng)分生孢子對(duì)寄主的附著、萌發(fā)、直接穿透表皮，菌絲在血腔內(nèi)生長(zhǎng)，產(chǎn)生白僵素(大環(huán)脂類(lèi)毒素)和草酸鈣結(jié)晶，引起昆蟲(chóng)中毒，導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡。白僵菌主要通過(guò)昆蟲(chóng)體壁侵入蟲(chóng)體內(nèi)。對(duì)咀嚼式和刺吸式口器的害蟲(chóng)都有效果。它與環(huán)境具有很好的相容性，對(duì)人畜安全，對(duì)有益昆蟲(chóng)無(wú)毒害，并且還能夠在環(huán)境中存活、擴(kuò)散、定殖，保持一定的種群數(shù)量，從而能夠持續(xù)使害蟲(chóng)數(shù)量處于低水平狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)植物保護(hù)和環(huán)境保護(hù)的可調(diào)持續(xù)發(fā)展。因此，白僵菌在害蟲(chóng)綜合治理方面受到了越來(lái)越多的關(guān)注，成為生物農(nóng)藥研究和發(fā)展的理想選擇之一。

球孢白僵菌已開(kāi)發(fā)成為廣泛應(yīng)用的微生物殺蟲(chóng)劑。1995年美國(guó)環(huán)保暑(EPA)允許Mycotech公司生產(chǎn)的球孢白僵菌制劑Mycotrol?RWP用于防治蚜蟲(chóng)和粉虱。我國(guó)20世紀(jì)50年代開(kāi)始白僵菌的研究和應(yīng)用，2006年球孢白僵菌在我國(guó)獲得登記。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)應(yīng)用白僵菌對(duì)近40種農(nóng)林害蟲(chóng)進(jìn)行了有效防治，主要包括松毛蟲(chóng)、玉米螟、茶小綠葉蟬、蠐螬、蝗蟲(chóng)、桃小食心蟲(chóng)、黃地老虎、地老虎、馬鈴薯甲蟲(chóng)、松褐天牛、白蟻、水稻葉蟬、木麻黃毒蛾、樟榮葉甲、甘薯象甲、茶小綠葉蟬、大豆食心蟲(chóng)、三化螟、糜子地老虎、黑翅白蟻、甜菜象甲、三葉草夜蛾、白楊透翅蛾等。應(yīng)用球孢白僵菌防治松毛蟲(chóng)、玉米螟是世界上殺蟲(chóng)真菌應(yīng)用面積最大、最為成功的事例之一，目前仍保持50萬(wàn)hm²/年，應(yīng)用面積最高年份達(dá)134萬(wàn)hm²，其中，球孢白僵菌對(duì)松毛蟲(chóng)的防治效果可達(dá)90％以上。

但是，球孢白僵菌也和其他生物農(nóng)藥一樣也具有較長(zhǎng)的侵染潛伏期，擊倒害蟲(chóng)速度慢、防效不穩(wěn)定、殺蟲(chóng)譜過(guò)窄等缺點(diǎn)，這一直是影響其應(yīng)用推廣的重要因素，也導(dǎo)致真菌殺蟲(chóng)劑在農(nóng)藥市場(chǎng)的占有率低。