[發明專利]一種拉薩小檗胚性愈傷組織誘導及快速增殖的方法

有效

• 申請號: 201911124590.8
• 申請日: 2019-11-15
• 公開（公告）號: CN110731270B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 林良科;溫鏗
• 申請（專利權）人: 四川億源農業有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 四川國信鼎創專利代理事務所(特殊普通合伙) 51331
• 代理人: 李永芬

本發明公開了一種拉薩小檗胚性愈傷組織誘導以及快速增殖的方法，本發明對特定周期內的拉薩小檗的種子胚在暗條件下進行愈傷組織誘導，本發明以拉薩小檗種子為材料產生的胚性愈傷組織既可用于細胞懸浮培養獲得代謝產物，也可以經體細胞胚胎發生或器官發生獲得再生植株，進而達到快速繁殖的目的，材料活性高、增殖倍數可達到3～7倍，小檗堿含量穩定，可用于工廠化生產。

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，尤其涉及一種拉薩小檗胚性愈傷組織誘導及快速增殖的方法。

背景技術

拉薩小檗(Berberis hemsleyana Ahrendt)又名三顆針，是小檗科小檗屬灌木，主要生長于我國青藏高原高海拔地區，據伊尼巖和盧曉東《拉薩、林芝、山南地區三棵針資源》調查，尤其以日喀則、拉孜、拉薩、山南、林芝地區資源最為豐富,另據賀家仁和劉志斌《甘孜州高等植物》記載，四川巴塘縣中心絨地區也有分布。拉薩小檗對環境適應性強，耐旱耐蔭，對水分和光照條件要求不嚴,在海拔3000m至5000m之間的高原地帶分布廣泛。拉薩小檗根莖部位的皮可入藥，主治赤痢、黃疸、咽痛、目赤、跌打損傷。據研究發現，拉薩小檗富含小檗堿(黃連素)，是其主要的藥效活性成分，其小檗堿含量在眾多小檗屬植物中名列前茅。

然而目前對于拉薩小檗的研究多限于野生資源調查及生態學研究，鮮有人工利用方面的報道，現有關于拉薩小檗的已公開技術尚為空白,利用拉薩小檗生產小檗堿可通過植物細胞大規模培養次生代謝產物，應用細胞培養技術將外植體脫分化誘導為愈傷組織并使之大量增殖，產生所需的小檗堿，但這種方式在拉薩小檗上尚未見實際應用。

發明內容

本發明提供一種拉薩小檗胚性愈傷組織誘導及快速增殖的方法。

包括以下步驟：

A挑選采集于10～11月間的顆粒飽滿、無損傷的拉薩小檗種子作為外植體；

B對所述外植體進行預處理以及消毒處理；

C將所述外植體在無菌環境下取出完整種子胚。

D將所述種子胚接種到誘導培養基中，進行14～18d第一次暗培養獲得愈傷組織。

E對誘導獲得的所述愈傷組織中取細胞團接種到增殖培養基中繼續第二次暗培養直至形成胚性愈傷。

具體地，所述增殖培養基中每14～21d進行一次繼代培養。

作為優選，所述誘導培養基的配方包括B5培養基、KT 0.2～0.4mg/L、NAA 1.0～2.0mg/L、瓊脂5.8g/L、蔗糖30g/L，pH條件為5.8。

具體地，所述增殖培養基的配方包括MS培養基、BA 0.2～0.4mg/L、NAA 1.0mg/L，瓊脂5.2g/L，蔗糖20g/L，pH條件為5.8。

作為優選，所述預處理包括用0.1～0.15mg/ml赤霉素浸泡24h以打破所述拉薩小檗種子的休眠狀態，用清水沖洗20～30min，用濾紙吸除所述拉薩小檗種子表面水分。

具體地，所述消毒包括用70％～75％酒精消毒30s后，用無菌水沖洗2次，再用0.1％升汞消毒10～15min，用無菌水沖洗5次后，使用無菌濾紙吸除拉薩小檗種子表面水分。

作為優選，所述暗培養的培養條件為：保持每天24h遮光，溫度22～26℃、相對濕度為75％～95％、氣壓為60～80kPa、CO₂濃度為1000～1500ppm。

本發明的有益效果為：

本發明以拉薩小檗種子為材料產生的胚性愈傷組織既可用于細胞懸浮培養獲得代謝產物，也可以經體細胞胚胎發生或器官發生獲得再生植株，進而達到快速繁殖的目的，材料活性高、增殖倍數可達到3～7倍，小檗堿含量穩定，可用于工廠化生產。

附圖說明