[發明專利]一種腫瘤抗原特異性腫瘤浸潤性T細胞的分離方法

有效

• 申請號: 201911122814.1
• 申請日: 2019-11-16
• 公開（公告）號: CN110713978B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 謝云青;鄭秋紅
• 申請（專利權）人: 福建省腫瘤醫院（福建省腫瘤研究所;福建省癌癥防治中心）
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/09
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

1.腫瘤抗原特異性腫瘤浸潤性T細胞的分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：腫瘤組織單細胞懸液的制備，即從腫瘤組織塊或癌性胸腹水中獲取含有腫瘤特異性TIL細胞的單細胞懸液；

步驟二：將所得的單細胞懸液加入高效擴增劑1中培養1~4d；

步驟三：使用流式分選細胞技術對步驟二中的細胞懸液進行分離，得到腫瘤抗原特異性TIL細胞；

步驟四：將分選所獲得的腫瘤抗原特異性TIL細胞加入高效擴增劑2在體外繼續進行擴增培養，得到大量的具有腫瘤特異性殺傷活性的TIL細胞；

所述步驟一具有以下分步驟：

取腫瘤組織塊，去除壞死組織和血管、包膜，用無菌剪刀剪成1cm²左右小塊組織，再慢慢剪碎簡稱肉糜狀，加入5ml含組織消化酶組合劑的1640細胞培養基，緩慢搖晃4~6小時，可見腫瘤組織已消化成糜狀后，用100um細胞濾網過濾去除細胞團塊，得到單個細胞懸液；加入50mL?GT-T551?H3培養基重懸；將腫瘤組織中獲得的單個細胞懸液用Ficoll淋巴細胞分離液進行密度梯度分離，獲得單個核細胞；

或直接取癌性胸腹水用Ficoll淋巴細胞分離液進行密度梯度分離，獲得單個核細胞沉淀；

所述步驟二具體操作如下：

將所得的單個核細胞沉淀加入GT-T551?H3細胞培養基重懸，調整細胞濃度為5×10⁵~1×10⁶個/ml，并加入促TIL細胞高效擴增劑1，置于6孔細胞培養板中，2ml/孔，37℃，5%CO₂條件下培養1~4d進行快速擴增；

所述步驟三具體操作如下：將步驟二所得的單個核細胞離心收集后，按1×10⁶個/ml的濃度將細胞沉淀重懸于PBS緩沖液中，然后按照10⁶個細胞加入1ug抗體的比例，加入CD4、CD8、PD-1流式檢測抗體進行標記30分鐘，然后加入PBS緩沖液洗滌、重懸后上機分選，按照貝克曼MoFlo?XDP流式分選儀的操作步驟進行分選，收集CD8^+?PD-1⁺腫瘤抗原特異性的TIL細胞；

所述步驟四具體操作如下：

子步驟1：將步驟三所得的CD8^+?PD-1^+?TIL細胞亞群離心后，細胞沉淀加入GT-T551?H3細胞培養基調整細胞濃度為1×10⁶個/ml，加入促TIL細胞高效擴增劑2，置于75cm²細胞培養瓶中，37℃，5%CO₂條件下繼續進行培養；

子步驟2：根據細胞擴增的情況進行擴瓶培養，擴增所加的培養基為含有終濃度300u/mL?IL-2的GT-T551?H3培養基；

子步驟3：培養至第15~20天，細胞不再呈指數擴增時，收集獲得最終的腫瘤特異性TIL細胞，利用實時無標記細胞功能分析儀檢測殺瘤活性；

所述含組織消化酶組合劑的1640細胞培養基為在1640細胞培養基中添加終濃度2~10mg/ml的膠原酶、終濃度0.1~5mg/ml的透明質酸酶、終濃度10~500U/ml的DNA酶I；

所述促TIL細胞高效擴增劑1為在GT-T551?H3細胞培養基中添加終濃度1000~5000U/ml的IL-2、終濃度500~2000U/ml的IFN-γ、終濃度0.1~10ug/ml的CD3單抗；

流式檢測腫瘤特異性TIL細胞標記所用的CD4抗體為FITC熒光染料標記、CD8抗體為ECD熒光染料標記、PD-1為PE熒光染料標記，分選收集CD8^+?PD-1⁺腫瘤抗原特異性的TIL細胞；

所述促TIL細胞高效擴增劑2為在GT-T551?H3細胞培養基中添加終濃度500~5000U/ml的IL-2、終濃度0.5~3ug/ml的IL-15、終濃度0.5~3ug/ml的IL-7、終濃度1~3ug/ml的抗PD-1單抗。

2.一種如權利要求1所述的腫瘤抗原特異性腫瘤浸潤性T細胞的分離培養方法在制備腫瘤抗原特異性TIL細胞中的應用。