[發明專利]一種腫瘤抗原特異性腫瘤浸潤性T細胞的分離方法

有效

• 申請號: 201911122814.1
• 申請日: 2019-11-16
• 公開（公告）號: CN110713978B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 謝云青;鄭秋紅
• 申請（專利權）人: 福建省腫瘤醫院（福建省腫瘤研究所;福建省癌癥防治中心）
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/09
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明提供了一種來源于腫瘤組織或者腫瘤患者胸腹水腫瘤特異性腫瘤浸潤性T細胞（Tumor?Infiltrating?Lymphocytes,TIL）細胞的分離培養方法，屬于細胞工程技術領域。本發明利用CD8、PD?1抗體作為分離TIL細胞中腫瘤特異性T淋巴細胞的標記，并結合流式分選技術將腫瘤抗原特異性T淋巴細胞從TIL細胞群中分離出來，結合體外高效擴增技術，獲得特異性殺傷腫瘤活性較高的腫瘤抗原特異性TIL細胞。本發明的技術方案可明顯縮短TIL細胞體外分離培養的時間，制備工藝易于操作，成本低廉，便于推廣使用，可分離獲得殺傷腫瘤更特異、活性更強的腫瘤抗原特異性的TIL細胞。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，尤其是涉及一種腫瘤抗原特異性浸潤性淋巴細胞的分離培養方法。

背景技術

目前，腫瘤的治療進入了一個瓶頸階段，因此，我們在不斷革新傳統的腫瘤治療方法時，應積極尋求新的腫瘤治療手段。2013年腫瘤免疫療法被《科學》雜志評為最重大的科學突破，并已成為與手術、放療和化療并列的腫瘤第四大治療模式，腫瘤免疫治療正在表現出對抗腫瘤的巨大潛力。隨著“精準醫療計劃“的提出，腫瘤精準細胞免疫治療也應運而生，并有望成為腫瘤精準治療的重要突破口，而腫瘤浸潤的淋巴細胞（Tumor?infiltratinglymphocytes，TIL）因其對腫瘤細胞具有較強的特異性殺傷作用也成為腫瘤精準細胞免疫治療的研究熱點之一。

TIL是腫瘤抗原誘導的，主要存在于腫瘤間質的異質性淋巴細胞群，是由NIH的Rosenberg在90年代中期發明的，他直接從手術切除的腫瘤組織中分離擴增淋巴細胞用于黑色素瘤患者回輸，同時配合化療和高濃度IL-2，能夠使20%黑色素瘤患者達到完全緩解的狀態，持續時間超過3年?(Rosenberg?SA,?et?al.?Clin?Cancer?Res,?2011;17(13):4550–7)。隨后TIL的臨床應用越來越廣泛。2015年，Baldan?V等利用TIL聯合化療治療120例晚期腎癌患者中，總緩解率為38%，其中完全緩解13例（11%）、部分緩解32例（27%），18例部分緩解患者的腫瘤縮小了90%，完全緩解患者無瘤期為7～8個月（Br?J?Cancer?,2015,112:1510-1518）。DENIGER等2017年研究納入11例晚期惡性黑色素瘤患者，非清髓后給予TIL和trametinib聯合治療，結果3年內11例患者中有7?例有臨床癥狀部分緩解，2?例患者臨床癥狀完全緩解（Clin?Cancer?Res,?2017,?23:351-362）。

目前臨床應用的TIL細胞主要來源于兩個方面：（1）手術切除的腫瘤組織或淋巴結；（2）癌性胸腹水。從手術樣品分離TIL細胞一般需要經過機械剪切或蛋白酶消化等步驟后，再利用Ficoll分離得到單個核細胞，而癌性胸腹水來源的TIL細胞分離相對簡單，可直接通過Ficoll進行分離。傳統的TIL細胞的分離培養包括以下步驟：

（1）從腫瘤患者腫瘤組織剪切或消化后或癌性胸腹水中利用Ficoll分離得到單個核細胞；

（2）將所得到的單個核細胞加入TIL細胞培養基中，再加入擴增因子，然后置于37℃、5%CO₂培養箱中培養，進行TIL細胞的擴增培養。