[發明專利]一種密碼子優化的玉足海參α-淀粉酶基因及其重組表達載體與應用

有效

• 申請號: 201911119796.1
• 申請日: 2019-11-15
• 公開（公告）號: CN110791513B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 任春華;吳小芬;阮堯;陳廷;江曉
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/26;C12R1/19
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣;劉明星

本發明提供了一種密碼子優化的玉足海參α?淀粉酶基因及其重組表達載體與應用。在玉足海參α?淀粉酶基因序列基礎上，對該基因信號肽后的前20個氨基酸的密碼子進行優化，該優化的玉足海參α?淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明優化的玉足海參淀粉酶基因序列所編碼的氨基酸序列與原基因序列編碼一致，但可以在原核表達系統(大腸桿菌BL21)中成功表達出具有α?淀粉酶活性的蛋白。而未優化的α?淀粉酶序列無法在原核表達系統中表達。

技術領域

本發明涉及基因改造與蛋白表達技術領域，具體涉及一種密碼子優化的玉足海參ɑ-淀粉酶基因及其重組表達載體與應用。

背景技術

淀粉酶是一種水解酶，是目前發酵工業上應用最廣泛的一類酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉和糖原等α-1,4-葡聚糖，水解其α-1,4-糖苷鍵。根據作用的方式，淀粉酶可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶能水解淀粉中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，將淀粉切成長短不一的短鏈糊精和少量的低分子糖類，從而使淀粉糊的黏度迅速下降，起到降低稠度和“液化”的作用，從而提高動物腸道消化食物和吸收營養的能力。在魚類研究中，α-淀粉酶被認為是魚類幼體消化能力成熟的標志。在海參幼體發育前期，淀粉酶可作為一種飼料調節劑，提高海參的攝食和消化吸收效率。

玉足海參(Holothuria leucospilota)屬于楯手目(Aspidochirotida)、海參科(Holothuriidae)、海參屬(Holothuria)，在海洋生態修復方面起重要作用。基于玉足海參對推動我國熱帶海參資源恢復的積極作用，中國科學院南海海洋研究所相關課題組率先開展了玉足海參的人工育苗和養殖研究。為了提高海參的攝食和消化吸收效率，課題組試圖通過原核表達的方法獲得玉足海參α-淀粉酶。然而，玉足海參的α-淀粉酶基因無法在原核表達系統中成功表達，因此需要借助基因改造的方法來使玉足海參α-淀粉酶在原核表達系統中進行表達。

在眾多的基因改造技術中，密碼子優化技術是目前應用較廣泛的技術。密碼子優化是基于氨基酸具有密碼子簡并性的原理，通過改變基因序列中的一個或多個適合在原核表達系統中表達的密碼子，而不改變原有的氨基酸序列，以確保表達的蛋白和內源分泌的蛋白具有相同的理化特性。

發明內容

本發明的目的是提供一種密碼子優化的玉足海參α-淀粉酶基因及其重組表達載體與應用。通過密碼子優化使玉足海參的α-淀粉酶基因在原核表達系統中成功表達出具有α-淀粉酶活性的蛋白，進而為人工養殖海參提供一種飼料調節劑，提高海參的攝食和消化吸收效率。

為實現上述發明目的，本發明以本課題組構建的玉足海參第二代轉錄組數據庫中的α-淀粉酶基因的部分序列為基礎，通過RACE技術獲得該基因的全長序列，然后在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測出其開放讀碼框(ORF)。結果顯示該淀粉酶基因全長cDNA為1734bp，開放閱讀框(ORF)為1578bp，編碼525個氨基酸，預測的分子量大小為59.34KDa。該蛋白在N端含有信號肽和淀粉酶功能結構域，其中包括催化活性位點(圖1)。

在圖1所示玉足海參ɑ-淀粉酶基因序列基礎上，對該基因信號肽后的前20個氨基酸的密碼子進行優化。具體如下：(a)將第2和17位氨基酸密碼子TTC替換為TTT；(b)將第6位氨基酸密碼子GCC替換為GCG；(c)將第7位氨基酸密碼子GTT替換為GTG；(d)將第8位氨基酸密碼子GGA替換為GGC；(e)將第10位氨基酸密碼子CGT替換為CGC；(f)將第12位氨基酸密碼子ACA替換為ACC；(g)將第13位氨基酸密碼子ATA替換為ATT；(h)將第16位氨基酸密碼子CTT替換為CTG；(i)將第18位氨基酸密碼子AGT替換為AGC。