[發明專利]一種獲取木本植物維管形成層的方法及其應用

有效

• 申請號: 201911117532.2
• 申請日: 2019-11-15
• 公開（公告）號: CN110926851B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 張建霞;王雪;彭昌操;趙小蘭;龍健梅
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N1/06
• 分類號: G01N1/06;G01N1/36
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 黃瑩

本發明提供了一種獲取木本植物維管形成層的方法及其應用，所述的方法將含有維管形成層的木本植物組織石蠟切片用激光顯微切割方法獲取其中的維管形成層。本發明通過石蠟切片和激光顯微切割技術的有機結合，成功分離得到木本植物黃梁木的純的形成層組織。本發明優化了石蠟切片流程，調試LMD參數，建立了黃梁木實生苗維管組織細胞的激光顯微切割技術體系，獲得了高質量的維管形成層。本發明公開的方法在木本植物同類組織中應用未見報道，該方法獲得的組織器官細胞同質性較高，細胞結構完整，為進一步研究形成層的分子生物學及基因組學研究奠定基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種獲取木本植物維管形成層的方法及其應用。

背景技術

木材的徑向生長是維管形成層向內分化為次生木質部和向外分化為次生韌皮部的結果，維管形成層對于木本植物的生長至關重要，它是林木區別于其他一年生或多年生草本植物的主要組織，形成層活性導致了莖的增厚，并且伴隨著生物量的增加。除此之外，維管形成層還能在植物的受傷部位形成愈傷組織從而進行自我保護，在惡劣的生長環境中休眠以避免細胞受到傷害。因此研究維管形成層基因表達特性和形成層細胞的分裂與分化的分子遺傳機制，將為木本植物生物量遺傳改良及抗性篩選奠定重要基礎。但由于傳統的方法很難將影響木材形成的關鍵活性組織區域形成層完整清晰地分離處理，人們對形成層的認識還相當有限。如何提高取材部位的準確性，是研究形成層區細胞分化分子機理的關鍵所在。

激光顯微切割技術(Laser Microdissection，LMD)是一種從異質細胞群中分離目標細胞的有效技術。LMD常與冷凍切片和石蠟切片相結合，收獲的細胞可以提取DNA、RNA和蛋白質，用于分析來自各種細胞類型的基因組特征、基因表達和蛋白質譜。冷凍切片由于制片流程簡單，可減少RNA損失并提高質量，但冷凍切片難以穩定植物組織中的液泡細胞，以及冷凍、解凍引起的組織完整性的喪失，這使得靶細胞的鑒定變得困難(Nelson et al.,2006)。而石蠟切片能更好地保留細胞結構，與LMD結合廣泛應用于草本植物細胞材料，如擬南芥胚胎表皮細胞，玉米籽粒早期胚乳細胞等(Sakai et al.,2018；Zhang et al.,2018)。基于LMD的植物組織RNA分離過程中的主要困難是由于細胞壁的存在，次生細胞壁的木質化，完全分化的細胞中存在大的液泡，以及存在大的細胞間隙(Nakazono et al.,2003；Jyske et al.,2015；)，使得LMD應用于木本植物植物細胞成為挑戰，需要保持組織切片和細胞收獲期間組織學完整性和穩定的細胞內容物非常困難。目前，LMD結合石蠟切片應用在木本植物的相關報道較少，主要還是木本植物的非木質化組織，例如柑橘珠心胚起始細胞，蘋果芽分生組織等(賈慧慧，2016；Verma et al.,2019)。LMD結合石蠟切片應用于木本植物維管組織未見報道。

黃梁木(Neolamarckia cadamba)是熱帶亞熱帶地區廣泛分布的茜草科團花屬速生闊葉樹種，不僅生長十分迅速而且材質致密，它也是膠合板工業、紙漿和紙張生產的最佳原材料之一。黃梁木因其快速增長而被世界林業大會于1972年稱為“奇跡之樹”，其快速生長依賴于維管形成層細胞高活性的發生與分裂，因此，解析黃梁木維管形成層細胞發生與分裂的分子調控機制對于促進熱帶亞熱帶闊葉樹種的遺傳改良與應用具有重要作用。然而，在木本植物中尤其是速生樹種中如何獲得高質量的維管形成層仍然是一道技術難題，對于木本植物維管形成層發生與細胞分裂的分子調控機制也是知之甚少。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種獲取木本植物維管形成層的方法。

本發明的另一目的在于提供所述的獲取木本植物維管形成層的方法的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種獲取木本植物維管形成層的方法，將含有維管形成層的木本植物組織石蠟切片用激光顯微切割方法獲取其中的維管形成層。

所述的木本植物優選為黃粱木。