[發明專利]一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201911114799.6
• 申請日: 2019-11-14
• 公開（公告）號: CN110656204A
• 公開（公告）日: 2020-01-07
• 發明（設計）人: 王俊峰;李靜靜;趙章記;李振紅;杜美;付光宇;吳學煒;苗擁軍
• 申請（專利權）人: 鄭州安圖生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858
• 代理公司: 11227 北京集佳知識產權代理有限公司
• 代理人: 潘穎

1.一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括PCR反應液1，PCR反應液2，DNA內控，陽性質控品和陰性質控品；

PCR反應液1中包括：用于擴增YIDD突變的如SEQ ID NO：1、2所示的引物，如SEQ ID NO：3、4所示的DNA內控引物，用于檢測YIDD三種突變類型的如SEQ ID NO：5～7所示的探針，用于檢測YVDD三種突變類型的如SEQ ID NO：8～10所示的探針，如SEQ ID NO：11所示的DNA內控探針，PCR反應緩沖液，dNTPs，酶混合液；

所述PCR反應液2包括：MnCl₂，防腐劑，水。

2.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述用于擴增YIDD突變的引物濃度分別為20～30pmol/μL，DNA內控引物的濃度分別為20～30pmol/μL，用于檢測YIDD三種突變類型的探針濃度分別為3～15pmol/μL，用于檢測YVDD三種突變類型的探針濃度分別為3～15pmol/μL，DNA內控探針的濃度分別為10～15pmol/μL。

3.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述用于擴增YIDD突變的引物濃度分別為25pmol/μL，DNA內控引物的濃度分別為25pmol/μL，如SEQ ID NO：5、8、11所示的探針濃度分別為15pmol/μL，如SEQ ID NO：6、7、9、10所示的探針濃度分別為5pmol/μL，DNA內控探針的濃度分別為15pmol/μL。

4.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應緩沖液包括30～80mM基礎緩沖液Tris和增強劑。

5.根據權利要求4所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述增強劑為DMSO和甜菜堿，PCR反應緩沖液中DMSO的濃度為20vt％，甜菜堿的濃度為5m mol/L。

6.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述酶混合液包括具有5’-3’外切酶活性和DNA聚合酶活性的雙功能酶、UNG酶和酶保護液，其中雙功能酶含量為5～10U/μL，UNG酶含量為0.1～0.5U/μL。

7.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液1中dNTPs的濃度為10～30mM。

8.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液2中MnCl₂的濃度為20～30mM。

9.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液2中防腐劑的濃度為0.05w/v％～0.10w/v％疊氮化鈉。

10.一種非診斷目的檢測乙型肝炎病毒YMDD基因突變的方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步，樣本制備：

提取陽性質控品，陰性質控品以及待檢測樣品中的DNA，并在其中添加DNA內控；

第二步，聚合酶鏈式反應：

80μL PCR反應體系：PCR反應液120μL，PCR反應液2 10μL，模板DNA 50μL；

熒光定量PCR反應：50℃2min，93℃2min，93℃5s×45cyc，55℃20s×45，40℃10s；

熒光檢測通道選擇FAM、VIC、ROX；

第三步，結果判斷：

陰性質控品FAM通道No Ct，VIC通道No Ct，ROX通道Ct值≤40.0，陽性質控品三個通道Ct值≤30.0；

樣本YIDD陽性且Ct≤40，YVDD陰性，則判定該樣本為YIDD突變株；

樣本YIDD陰性，YVDD陽性且Ct≤40，則判定該樣本為YVDD突變株；

樣本YIDD陽性且Ct≤40，YVDD陽性且Ct≤40，則判定該樣本為YIDD、YVDD共生株；

樣本YIDD陰性，YVDD陰性，則判定該樣本為野生型株。