[發明專利]一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201911114799.6
• 申請日: 2019-11-14
• 公開（公告）號: CN110656204A
• 公開（公告）日: 2020-01-07
• 發明（設計）人: 王俊峰;李靜靜;趙章記;李振紅;杜美;付光宇;吳學煒;苗擁軍
• 申請（專利權）人: 鄭州安圖生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858
• 代理公司: 11227 北京集佳知識產權代理有限公司
• 代理人: 潘穎

本發明涉及體外診斷技術領域，特別涉及一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒包括PCR反應液1，PCR反應液2，DNA內控，陽性質控品和陰性質控品；PCR反應液1中包括：用于擴增YIDD突變的引物，DNA內控引物，用于檢測YIDD三種突變類型的探針，用于檢測YVDD三種突變類型的探針，DNA內控探針，PCR反應緩沖液，dNTPs，酶混合液；PCR反應液2包括：MnCl2，防腐劑。該試劑盒靈敏度高、檢測范圍廣、特異性強、擴增效率高、快速檢測、便于保存運輸。

技術領域

本發明涉及體外診斷技術領域，特別涉及一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，但不同地區HBV感染的流行強度差異很大。據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌(HCC)。全球肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分別為30％和45％，我國肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分別為60％和80％。根據國家衛計委2015年7月發布的信息顯示，我國乙肝病毒攜帶者約9000萬人，其中約2800萬人為慢性乙肝患者，每年約有33萬人死于乙肝或丙肝感染導致的肝硬化和原發性肝癌。每年乙肝新發感染者超過10萬人，乙肝仍是危害我國民眾健康的病因之一。

拉米夫定是用于抗HBV的主要藥物之一，它與乙肝病毒多聚酶結合后，競爭抑制多聚酶活性，使HBV-DNA的鏈合成終止，從而抑制病毒復制，進而達到控制炎癥、穩定病情甚至阻止肝纖維化的作用。拉米夫定因其抑制HBV效果明顯、使用方便、患者對其耐受性好而在乙肝病人的抗病毒治療中被廣泛應用。但是在長期應用過程中，HBV可發生變異而對拉米夫定產生耐藥性，抗病毒療效隨之降低。部分患者使用拉米夫定治療超過半年以上即發生耐藥，耐藥一旦發生，抗病毒療效將降低為原來的萬分之一。

國內外研究表明，拉米夫定治療期間，病毒DNA編碼的DNA聚合酶基因序列發生了變異，這種變異在YMDD序列及其附近，由野生型YMDD變異成YVDD或YIDD型，因而稱為YMDD變異。YMDD變異既有在拉米夫定應用后出現的，也有病人未用過拉米夫定卻出現了YMDD變異。當長期應用拉米夫定時，發生YMDD變異的比率逐年增加，應用拉米夫定1年時的平均YMDD變異率約為24％，2年、3年、4年和5年分別為38％、49％、67％和70％。當病毒發生了YMDD變異后，拉米夫定失去了對病毒的抑制作用，病毒重新出現復制，會伴有HBV DNA水平反跳和肝功能變化，甚至導致病情惡化。故開展YMDD變異的檢測很有必要，對及時調整治療方案、合理用藥及提高療效具有重要意義。

目前，國內已有多種基于熒光定量PCR技術的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒應用于臨床檢測中，這些試劑盒所提供的乙肝核酸提取方法主要是離心柱法，且擴增試劑需要于-20℃保存。該類試劑盒雖具有一定的優點，但仍存在很多不足：(1)離心柱法操作繁瑣，容易導致核酸“氣溶膠”污染；(2)擴增試劑-20℃的保存條件不利于保存和運輸；(3)提取和擴增時間比較長，延長了患者等待時間；(4)只檢測YIDD突變中的ATT型，YVDD突變的GTG型，新突變ATC、ATA、GTT和GTC型未能涵蓋；(5)沒有設置陽性內對照(即內標)，無法監控假陰性；(6)一般沒有預防PCR產物污染的措施。因此，研究開發一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒是目前急待解決的新課題。

現有公開的發明專利有相關的檢測突變型乙型肝炎病毒的方法，但這些方法不能覆蓋新的突變類型，且保存穩定性較弱。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒靈敏度高、檢測范圍廣、特異性強、擴增效率高、快速檢測、便于保存運輸。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：