[發(fā)明專利]狂犬病疫苗抗原含量檢測方法及試劑或試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911114462.5
• 申請日: 2019-11-14
• 公開（公告）號: CN112798787A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚小東;李杰玉;周沛;楊世龍
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司;重慶智飛生物制品股份有限公司;北京智飛綠竹生物制藥有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/535
• 代理公司: 北京知聯(lián)天下知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11594
• 代理人: 張陸軍;張迎新

本發(fā)明提供了一種狂犬病疫苗抗原含量檢測方法及試劑或試劑盒，所述檢測方法包括：制備單克隆抗體包被酶標(biāo)板，并固相化所述單克隆抗體；將待測疫苗、標(biāo)準(zhǔn)疫苗分別按照倍比梯度稀釋，加入所述單克隆抗體包被酶標(biāo)板中，孵育；再加入鼠多克隆抗體作為一抗，再加入適宜稀釋度的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠過氧化物作為二抗，獲取所述標(biāo)準(zhǔn)疫苗和所述待測疫苗在波長450nm處的OD值，計(jì)算所述待測疫苗的濃度。本發(fā)明通過設(shè)置人源化單克隆抗體包被酶標(biāo)板、多克隆抗體作為一抗進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測狂犬病毒疫苗的抗原含量，且本發(fā)明的檢測方法檢測周期短、檢測原料可長期儲存，疫苗效價(jià)的檢測結(jié)果簡單易得。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，特別涉及一種狂犬病疫苗抗原含量檢測方法及試劑或試劑盒。

背景技術(shù)

狂犬病是一種由狂犬病毒引起的人獸共患傳染病，一旦發(fā)病，死亡率幾乎達(dá)100％?？袢〔《咎堑鞍?GP)是狂犬病毒的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，同時(shí)還與病毒的毒力、神經(jīng)嗜性，神經(jīng)和腦內(nèi)的運(yùn)輸、侵染和分布等有關(guān)?？袢∫呙绲男r(jià)與病毒的糖蛋白密切關(guān)聯(lián)，而現(xiàn)行版藥典推薦NIH法體外檢測作為狂犬病疫苗效價(jià)評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

NIH法是采用小鼠體內(nèi)注射疫苗后，再用CVS攻擊毒攻毒，經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)抗原比較后計(jì)算疫苗效價(jià)。NIH法檢測需要大量小鼠，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)周期約一個(gè)月時(shí)間，導(dǎo)致狂犬疫苗檢測周期延長。且實(shí)驗(yàn)過程中由于活體參與，對小鼠狀態(tài)和表現(xiàn)需要密切觀察，導(dǎo)致檢測成本高，疫苗效價(jià)計(jì)算繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種狂犬病疫苗抗原含量檢測方法及試劑或試劑盒。

一種狂犬病疫苗抗原含量檢測方法，所述檢測方法包括：

制備單克隆抗體包被酶標(biāo)板，并固相化所述單克隆抗體；

將待測疫苗、標(biāo)準(zhǔn)疫苗分別按照倍比梯度稀釋，將所述單克隆抗體包被酶標(biāo)板洗板、拍干，將不同梯度稀釋的所述待測疫苗和所述標(biāo)準(zhǔn)疫苗分別加入所述單克隆抗體包被酶標(biāo)板中，37℃孵育1h；

將含有所述待測疫苗和標(biāo)準(zhǔn)疫苗的酶標(biāo)板洗板拍干，再加入鼠多克隆抗體作為一抗，將含有所述一抗的酶標(biāo)板封口后置于37℃孵育1h～2h；

將所述含有一抗的酶標(biāo)板洗板拍干，再加入適宜稀釋度的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠過氧化物作為二抗，得到含有二抗的酶標(biāo)板，37℃孵育1h～2h；

將所述含有二抗的酶標(biāo)板的洗板后，加入顯色液，室溫下避光反應(yīng)設(shè)定時(shí)間，再加入終止液終止反應(yīng)；

將所述終止反應(yīng)的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，獲取所述標(biāo)準(zhǔn)疫苗和所述待測疫苗在波長450nm處的OD值，計(jì)算所述待測疫苗的濃度。

進(jìn)一步地，制備所述單克隆抗體包被酶標(biāo)板包括：

取所述單克隆抗體稀釋后，加入酶標(biāo)板中，2-8℃孵育過夜；

將所述單克隆抗體包被酶標(biāo)板洗板3次后，加入封閉液封閉所述抗體，

再加入磷酸緩沖鹽溶液將所述單克隆抗體固相化，制得所述單克隆抗體包被酶標(biāo)板。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體為針對狂犬病病毒糖蛋白抗原表位的人源化單克隆抗體。

進(jìn)一步地，所述單克隆抗體包被酶標(biāo)板內(nèi)單克隆抗體添加量為100μl/孔，所述單克隆抗體濃度為1-20μg/ml。

進(jìn)一步地，所述封閉液為牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和葡萄糖中的一種，所述封閉液添加量為300μl/孔。

進(jìn)一步地，所述磷酸緩沖鹽溶液內(nèi)含有蔗糖和果糖。

進(jìn)一步地，所述多克隆抗體采用鼠腦來源狂犬病病毒制備。

進(jìn)一步地，計(jì)算所述待測疫苗的濃度包括：