[發明專利]華支睪吸蟲液滴式數字PCR檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201911112701.3
• 申請日: 2019-11-14
• 公開（公告）號: CN110760596A
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 沈玉娟;徐夢;曹勝魁;張小凡;曹建平
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 31325 上海市匯業律師事務所
• 代理人: 王函

本發明公開了一種華支睪吸蟲液滴式數字PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括根據華支睪吸蟲細胞色素C氧化酶亞單位1基因COI基因設計的特異性引物及熒光探針。此外，本發明還公開了用于檢測華支睪吸蟲的引物和探針以及所述的引物和探針在制備感染華支睪吸蟲疾病診斷產品中的應用。所述引物的上游引物為如SEQ ID NO.1所示序列；下游引物為如SEQ ID NO.2所示序列；所述探針為如SEQ ID NO.3所示序列。本發明成功建立了一種可高效檢測、華支睪吸蟲糞便DNA的高靈敏的檢測試劑盒，快速、敏感和特異，可用于華支睪吸蟲感染，尤其是輕度感染的檢測。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種PCR檢測試劑盒，尤其涉及一種華支睪吸蟲液滴式數字PCR檢測試劑盒。 此外，本發明涉及華支睪吸蟲液滴式數字PCR檢測試劑盒的應用。

背景技術

華支睪吸蟲是一種重要的食源性疾病，最新調查顯示，我國約有598萬感染者，珠江三角洲城鎮與城郊生態區、東北平原西部生態區及三江平原生態區的華支睪吸蟲病呈高度流行狀態，感染率分別為23.36%、9.44%和8.53%。食魚生的飲食習慣是致流行區人群華支睪吸蟲感染的主要危險因素。華支睪吸蟲病可致275 370個傷殘調整壽命年的損失，造成嚴重的經濟負擔。急性、嚴重感染會出現非特異性消化系統相關臨床癥狀，如腹痛、腹瀉、黃疸、膽囊炎、膽道纖維化、膽道結石等，慢性反復性感染會致肝膽管癌，2009年華支睪吸蟲被國際癌癥腫瘤機構列入Ι類致癌物。

目前華支睪吸蟲的檢測主要仍然依靠糞便鏡檢（改良加藤厚涂片法），該方法被認為是確診華支睪吸蟲感染依據的金標準，但其靈敏度不高，易出現漏診、錯診，且需依賴檢測人員的經驗和鏡檢能力。近年來，隨著分子生物學技術的發展，各種核酸檢測方法用于華支睪吸蟲感染的檢測，如環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）、ELISA、PCR及實時熒光定量PCR，但這些檢測方法受到樣本核酸純度、核酸抑制物或者抗體濃度等因素的影響而影響檢測效率。中國發明專利CN201410676271公開了華支睪吸蟲實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。而熒光定量PCR方法依賴標準品和標準曲線實現樣本定量檢測，但目前尚無法實現絕對定量。

ddPCR（液滴式數字PCR，Droplet digital PCR）是近幾年發展起來的一種全新的核酸檢測方法，其首先通過將微量DNA樣本進行大量稀釋，利用微流控技術產生大量的獨立油包水乳化反應微滴，每個微滴不含有或含有一個至數個模板分子，通過PCR反應擴增，之后通過對每個微滴的熒光信號進行統計分析，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例定量DNA拷貝數。ddPCR方法不需要依賴標準品和標準曲線即可實現樣本的絕對定量，且不易受到DNA樣本中所含核酸抑制物或抗體濃度等因素的影響而影響檢測效率。該方法在一定程度上彌補了以往PCR檢測方法的不足，可實現低濃度核酸樣本的高度靈敏和準確的絕對定量，檢測敏感性更高。但是并非所有的基因對象檢測都適用于ddPCR方法。目前尚未發現有采用ddPCR方法對華支睪吸蟲檢測的相關報道。本研究擬建立基于華支睪吸蟲COI 基因的ddPCR檢測試劑盒，為華支睪吸蟲病的早期、快速診斷等提供技術儲備，也為該病的防控提供技術支持。

發明內容

本發明要解決的技術問題之一在于提供一種華支睪吸蟲液滴式數字PCR檢測試劑盒。本發明以華支睪吸蟲為研究對象，開發了一種快速，敏感，特異，高靈敏度的檢測試劑盒。

本發明要解決的技術問題之二在于提供用于檢測華支睪吸蟲的引物和探針及其用途。

為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

在本發明的一方面，提供一種華支睪吸蟲液滴式數字PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括根據華支睪吸蟲細胞色素C氧化酶亞單位1基因COI基因設計的特異性引物及熒光探針。

作為本發明優選的技術方案，所述特異性引物及熒光探針的序列如下：