[發明專利]新型非病毒載體TSCM基因療法的構建方法及臨床應用

在審

• 申請號: 201911108309.1
• 申請日: 2019-11-13
• 公開（公告）號: CN112795593A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 路春光
• 申請（專利權）人: 路春光
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N5/0783;A61K39/00;A61P35/00;A61P31/12;A61P31/14;A61P31/20;A61P1/16;A61P31/06;A61P31/18
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1.一種臨床用PB-CAR-TSCM構建方法，其特征在于，包含從新鮮或低溫凍存的人體外周血單個核細胞或臍血單個核細胞中分離純化T細胞，T細胞誘導擴增干細胞樣記憶性T細胞（TSCM），通過轉座子載體系統搭建這一新CAR-TSCM平臺；

（1）構建基于PiggyBac的CAR載體(PB-CAR-basic)，分別以CD19和Her2為靶標，測序驗證序列正確；

（2）探索PB-CAR-basic電轉化TSCM細胞最佳條件，能達到最高轉染效率、最佳成活率和最佳細胞毒性，用體外細胞殺傷實驗初步證實其功能；

優選步驟（2）中電壓為200-250v，電轉次數1-2次；

（3）本發明包括抽取成人血液或采集臍血，用淋巴分離液分離單個核細胞(PBMCs或UBMC)，CD4+T細胞或CD8+T細胞或CD4-CD8-T細胞，用本人發明的TSCM誘導試劑盒誘導TSCM，直接用不同電轉化儀和電轉試劑盒，摸索電轉化條件，以實現最佳的轉化效率、生存率和TSCM細胞狀態，并用適當濃度的puro進行篩選，經過擴增后，流式檢測CAR-TSCM的狀態；

優選步驟（3）中，所述TSCM可用于制備CAR-TSCM細胞、UCAR-TSCM、TCR-TSCM或腫瘤浸潤性淋巴細胞。

2.權利要求1所述的制備PB-CAR-TSCM的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）外周血PBMC或臍血UBMC分離和T細胞純化：

（2）TSCM誘導試劑盒使用：

1）D0天將TSCM-II 配成12.5-50ug/ml工作液，包被到培養瓶中，平放于37℃培養箱中大于2小時；

2）T細胞按照細胞密度1×10⁶/mL用TSCM-III重懸，其中添加1-100ng/mL人白介素7、1-100ng /mL人白介素15和1-100ng/mL人白介素21、50-200ng/mL CD3單抗、50-200ng/mLCD28，第二天以后用 TSCM-I培養液對TSCM細胞進行擴增培養，第三天電轉PB-CAR，經過12-15天的擴增培養，收獲達到臨床應用標準的PB-CAR-TSCM細胞，并對細胞制劑進行內毒素、活性和表型檢測，細胞鑒定結果表明，細胞活性達到95%以上，同時含有較高比例的CD3+-BV421/CD4+-APC-Cy/CD8+APC/CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE細胞；

3）質量檢測合格的PB-CAR-TSCM細胞裝入50-100ml生理鹽水中，制成免疫細胞制劑，配合腫瘤臨床治療需要靜脈回輸。

3.根據權利要求2所述的干細胞樣記憶性免疫細胞，其特征在于步驟（2）中PB-CAR-TSCM細胞按照密度1x10⁶ml接種，采用TSCM-II包被培養瓶，采用T75、T175培養瓶和1L培養袋生產獲得了臨床應用PB-CAR-TSCM細胞，培養時間為12-28天。

4.根據權利要求2所述的干細胞樣記憶性免疫細胞，其特征在于誘導后使用非病毒載體PiggyBac（培養后第3天）電轉TSCM細胞，電轉前將TSCM-II 配成12.5-50ug/ml工作液，包被到六孔板中，平放于37℃培養箱中大于2小時。

5.根據權利要求2所述的干細胞樣記憶性免疫細胞，其特征在于在獲得本發明PB-CAR-TSCM之前，用生理鹽水洗滌并重懸所述PB-CAR-TSCM細胞3-4次，直至滿足《中國藥典》要求的無菌、內毒素的檢測指標，保證本發明的PB-CAR-TSCM細胞在回輸給患者是殘留的本發明所述的培養基組分和誘導因子組合物不會引起患者不適反應。