[發(fā)明專利]100bp DNA分子量標準物的制備方法、引物組及其應用

有效

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• 申請日: 2019-11-13
• 公開（公告）號: CN110714053B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設計）人: 傅向陽
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 覃蛟

本發(fā)明提供了一種100bp DNA分子量標準物的制備方法、引物組及其應用，涉及生物技術領域。該制備方法包括使用第一引物、第二引物和搭橋引物，經(jīng)PCR擴增得到100bp DNA分子量標準物；第一引物為如SEQ ID NO.1所示序列，或為和SEQ ID NO.1所示序列90％以上同源性的序列；第二引物為如SEQ ID NO.2所示序列，或為和SEQ ID NO.2所示序列90％以上同源性的序列；搭橋引物的3’端含有與第一引物的3’端10～15bp的反向堿基互補序列；搭橋引物的5’端含有與第二引物的3’端10～15bp的重復序列；PCR擴增產(chǎn)物的長度為100bp。該制備方法操作簡單，經(jīng)濟高效。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種100bp DNA分子量標準物的制備方法、引物組及其應用。

背景技術

脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)是一類大分子物質，通常作為遺傳信息的載體，對DNA的研究在生命科學研究中占據(jù)重要的地位。

電泳是常用于核酸檢測的方法。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在瓊脂糖凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就提供了很好的分辨能力。鑒于瓊脂糖凝膠電泳的特性，其常被用于DNA的檢測。

在電泳實驗時，常用已知分子量大小的DNA樣品作為參照物，以幫助實驗人員迅速判斷檢測DNA分子量的大小，這些已知分子量大小的DNA就是DNA分子量標準物。通常將分子量大小不同的DNA片段混合起來作為標準參照物，以方便實驗檢測。這些混合好的DNA分子量標準物常被叫做DNA Marker，除向生物技術公司購買外，實驗室也可以根據(jù)需要自行配制。

目前常用的DNA Marker有兩種，一種是質粒或病毒DNA經(jīng)過酶切獲得的，片段的分子量大小有零有整，如Lambda DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切得到6條帶，其大小分別為21226bp、7421bp、5804bp、5643bp、4878bp和3530bp，Lambda DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind III酶切則得到另外大小不同的8條帶；另外一種是固定數(shù)值的，比如100bp、200bp、500bp、1000bp、2000bp、10000bp等，它通常是先制備固定分子量的DNA分子量標準物，然后再混合而成，通過選擇不同的DNA分子量標準物混合得到不同的DNA marker產(chǎn)品。這后一種DNAmarker產(chǎn)品更方便用于對比觀察，因而更常用。

配制DNA marker產(chǎn)品，首先需要制備固定分子量的DNA分子量標準物。目前主要采用兩種方法，一種是常規(guī)PCR擴增，即采用模板(常用的模板為質粒，因其容易制備)和引物，PCR反應擴增出固定分子量的DNA分子量標準物如500bp、1000bp、2000bp等片段；另一種是酶切法，即先構建合適的質粒，提取質粒后再通過限制性內(nèi)切酶酶切，得到固定分子量的DNA分子量標準物。比如，構建好一個3000bp的質粒，通過對質粒上單一的限制性酶切位點切割得到3000bp的DNA分子量標準物，也可以在質粒上設計多個位點，酶切后得到多個DNA分子量標準物，采用這種方法后續(xù)的純化步驟會比較復雜。

但對于小分子量的DNA分子量標準物如100bp DNA片段的制備，上述兩種方法均不理想。質粒的自身結構決定了其至少有1000bp以上長度，能酶切出100bp大小片段的質粒即便構建出來，后續(xù)的制備工藝也很復雜；常規(guī)PCR擴增方法倒是簡單，但實驗中發(fā)現(xiàn)，小片段擴增效率低，用常規(guī)PCR法來制備100bp DNA片段并不經(jīng)濟。因而，尋找一種簡單、高效且經(jīng)濟的100bp DNA分子量標準物的制備方法顯得十分必要。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種100bp DNA分子量標準物的制備方法，該制備方法操作簡單，經(jīng)濟高效。

本發(fā)明的第二目的在于提供一組引物組，該引物組經(jīng)PCR反應能夠合成100bp DNA分子。