[發明專利]鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調節的分析方法

在審

• 申請號: 201911099430.2
• 申請日: 2019-11-12
• 公開（公告）號: CN110687287A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 張輝;張凱月;吳楠;杜延佳;李志成;李晶峰;邊學峰;呂金朋;蘭夢;高旭
• 申請（專利權）人: 吉林鑫水科技開發有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/68;C07K1/34
• 代理公司: 22206 長春市吉利專利事務所
• 代理人: 李曉莉

鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調節的分析方法，屬于生物技術研發分析技術領域，篩選出鹿胎寡肽作用后RAW264.7細胞的增殖指數較空白比明顯升高，且與LPS陽性對照組最為接近；本發明方法分析了不同質量濃度對吞噬功能、NO分泌量和細胞因子如IL?1β、IL?6、TNF?α的釋放的影響，獲得結果顯示，在25μg/mL時，NO有最大的釋放量，且與LPS組最為接近；本發明方法中同時進行細胞周期檢查，數據結果證明，隨著鹿胎寡肽質量濃度的增長，G0/G1期細胞比例呈先上升后下降趨勢，S期與G2/M期的細胞比例呈先下降后上升趨勢，在25μg/mL時，細胞各時期比例與LPS組最為接近；G0/G1為RNA和蛋白質的合成期，因此相關蛋白的表達量增加，所以吞噬作用、NO及細胞因子的分泌能力在此時期分泌量達最大值。

技術領域

本發明屬于生物技術研發分析技術領域，特別是涉及到鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調節的分析方法。

背景技術

鹿胎為鹿科動物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或馬鹿(Cervus elaphusLinnacus)的胎盤和胎獸。鹿胎是我國一種傳統名貴的滋補品，古時被譽為“婦科三寶”(鹿胎、烏雞、阿膠)之一。鹿胎作為中藥治療疾病已有很長歷史，其藥理作用首先載于《本草綱目》。鹿胎，調經養顏，解諸毒。中醫認為：鹿胎主治腎虛陽痿，滋補不足，適用于腎虛，無力，血液不足，女性月經不調，子宮出血等。鹿胎化學成分多樣，以氨基酸、維生素、肽類成分為主。其中，寡肽成分易吸收，活性高等優點，已被廣泛關注。

免疫系統是機體發揮免疫應答作用的重要系統，可防衛病原體入侵機體，它能發現引起內環境紊亂的外來異物和病原微生物等。其中，巨噬細胞作為機體最重要的吞噬細胞，是病原微生物進入機體的第一道防線，發揮免疫功能，具有吞噬、表達相應抗原遞呈分子、分泌多種細胞因子等功能，在機體廣泛參與清除病原微生物與衰老細胞，發揮免疫調節作用，以維持機體內環境的穩態，在天然免疫中起重要作用。現代研究表明，胎盤中含有多種活性成分，如生物活性肽、免疫球蛋白、氨基酸、礦物質等其他成分，是一種較為理想的免疫調節劑，其作用機制為通過調控巨噬細胞吞噬和抗原遞呈功能以及相關細胞因子的表達，從而參與巨噬細胞免疫應答反應。另有研究表明，生物活性肽類成分在免疫調節及抗氧化等方面表現出了重要的生理活性。但現有技術中鹿胎寡肽對巨噬細胞RAW264.7免疫調節的研究尚未開展。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調節的分析方法，采用超濾法提取鹿胎肽，將各超濾組分通過噻唑藍MTT實驗檢測各肽段的增殖活性，通過選用中性紅吞噬實驗，酶聯免疫吸附檢測法檢查鹿胎肽對免疫功能的影響，通過細胞周期實驗保證實驗結果的準確性，進而驗證不同鹿胎超濾組分對免疫調節的作用。

鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調節的分析方法，其特征是：包括以下步驟，且以下步驟順次進行，

步驟一、制備上清液

取鹿胎生品40g，粉碎至粒徑為60目，取鹿胎生品質量10倍～30倍量的蒸餾水，添加至粉碎后鹿胎生品中，在4℃的條件下，攪拌1次～3次，每次持續6小時～8小時，轉速為3600r/min，離心10分鐘～30分鐘后，取上清液；

步驟二、制備凍干粉

將步驟一獲得的上清液經過雙層濾油紙濾取后再經過0.45μm濾膜微濾、1KDa、3KDa、10KDa超濾膜超濾，采用超濾分離純化方法獲得分子總提液DFP-1、質量大于10KDa的鹿胎蛋白DFP-2、分子質量3KDa～10KDa鹿胎多肽DFP-3、分子質量1KDa～3KDa鹿胎多肽DFP-4、分子質量小于1KDa鹿胎寡肽DFP-5，凍干后取凍干粉備用；

步驟三、建立蛋白質標準曲線

精密稱定1.0mg牛血清白蛋白于10mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容至刻度，獲得濃度為0.1mg/mL的BSA標準溶液；