[發(fā)明專利]鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)的分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911099430.2
• 申請日: 2019-11-12
• 公開（公告）號: CN110687287A
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張輝;張凱月;吳楠;杜延佳;李志成;李晶峰;邊學峰;呂金朋;蘭夢;高旭
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林鑫水科技開發(fā)有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/68;C07K1/34
• 代理公司: 22206 長春市吉利專利事務(wù)所
• 代理人: 李曉莉

1.鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)的分析方法，其特征是：包括以下步驟，且以下步驟順次進行，

步驟一、制備上清液

取鹿胎生品40g，粉碎至粒徑為60目，取鹿胎生品質(zhì)量10倍～30倍量的蒸餾水，添加至粉碎后鹿胎生品中，在4℃的條件下，攪拌1次～3次，每次持續(xù)6小時～8小時，轉(zhuǎn)速為3600r/min，離心10分鐘～30分鐘后，取上清液；

步驟二、制備凍干粉

將步驟一獲得的上清液經(jīng)過雙層濾油紙濾取后再經(jīng)過0.45μm濾膜微濾、1KDa、3KDa、10KDa超濾膜超濾，采用超濾分離純化方法獲得分子總提液DFP-1、質(zhì)量大于10KDa的鹿胎蛋白DFP-2、分子質(zhì)量3KDa～10KDa鹿胎多肽DFP-3、分子質(zhì)量1KDa～3KDa鹿胎多肽DFP-4、分子質(zhì)量小于1KDa鹿胎寡肽DFP-5，凍干后取凍干粉備用；

步驟三、建立蛋白質(zhì)標準曲線

精密稱定1.0mg牛血清白蛋白于10mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容至刻度，獲得濃度為0.1mg/mL的BSA標準溶液；

分別吸取BSA標準溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，各管用蒸餾水補足至1.0mL，以空白管調(diào)零，每管加入5mL考馬斯亮藍試劑，渦旋混勻，室溫反應5min，于5min～20min之間595nm處測吸光度值；

以牛血清白蛋白標準溶液在每管中的蛋白濃度μg/mL為橫坐標x，以測得吸光度值為縱坐標Y作線性回歸，獲得測定蛋白質(zhì)含量的標準曲線回歸方程；

步驟四、樣品溶液測定

取步驟二獲得的凍干粉各1mg，加入1mL蒸餾水，配置1mg/mL樣品溶液，吸取1mL加入5mL考馬斯亮藍試劑，渦旋混勻，室溫反應5min，于5min～20min之間595nm處測吸光度值；

步驟五、測定細胞增殖指數(shù)

取對數(shù)生長期RAW264.7細胞以10⁵個/孔置于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔150μL，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入步驟二獲得的凍干粉配置成100μg/mL的溶液150μL，空白對照組為150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，陽性對照組為10μg/mL脂多糖LPS150μL，每組5個復孔；在37℃、5％CO₂條件下分別培養(yǎng)12h、24h、48h，棄去上清液，每孔加入5mg/mL的MTT噻唑藍溶液10μL，4h后加入DMSO二甲基亞砜150μL，振蕩5min，于490nm波長處測其透光度OD值，獲得細胞增殖指數(shù)；

步驟六、測定鹿胎寡肽DFP-5藥物刺激下細胞增殖指數(shù)

在DMEM高糖培養(yǎng)基中分別加入步驟二所得的分子質(zhì)量小于1KDa鹿胎寡肽DFP-5凍干粉配置成6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL溶液150μL，空白對照組為150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，陽性對照組為10μg/mL LPS細菌脂多糖150μL，每組5個復孔；在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24h，棄掉培養(yǎng)上清液，每孔加入5mg/mL的MTT噻唑藍溶液10μL，4h后加入DMSO二甲基亞砜150μL，振蕩5min，于490nm波長處測其透光度OD值，獲得細胞增殖指數(shù)；

步驟七、測定細胞吞噬指數(shù)

取對數(shù)生長期RAW264.7細胞以10⁵個/孔，每孔150μL于96孔板中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱孵育24h后，棄去培養(yǎng)液，并給予質(zhì)量濃度為12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿胎寡肽DFP-5藥物刺激，每組5個復孔，同時設(shè)定LPS細菌脂多糖組和空白組，孵育24h，吸出上清液，聚丁二酸丁二醇酯PBS洗滌2次，隨后加入200μL細胞培養(yǎng)液，同時加入中性紅染液20μL，孵育2h；除去含有中性紅染液的細胞培養(yǎng)液，聚丁二酸丁二醇酯PBS洗滌1次，于每孔加入中性紅檢測裂解液200μL，室溫搖床上裂解10min；于540nm波長處測定透光度OD值，獲取細胞吞噬指數(shù)；

步驟八、測定鹿胎寡肽DFP-5對RAW264.7細胞的細胞因子釋放的影響

將對數(shù)生長期RAW264.7細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200μL，密度為10⁵個/孔，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的DFP-5樣品溶液150μL，設(shè)定空白組和LPS細菌脂多糖組，每組5個復孔，于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24h后，取上清液150μL，按各試劑盒說明書測定NO分泌量、IL-1β分泌量、IL-6分泌量以及TFN-α分泌量；

步驟九、測定鹿胎寡肽DFP-5對RAW264.7細胞周期的影響

RAW264.7細胞濃度為10⁵個/mL，每孔2mL接種于6孔板中，24h后吸出培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿胎寡肽DFP-5，同時設(shè)置LPS細菌脂多糖組和空白組，繼續(xù)孵育，收集樣本細胞，細胞數(shù)量約為6×10⁶個，用冷聚丁二酸丁二醇酯PBS洗滌2次，吹散細胞至15mL離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，用500μL聚丁二酸丁二醇酯PBS重懸細胞，滴加3mL 75％冷乙醇，放入-20℃固定1h，離心，500μL冷聚丁二酸丁二醇酯PBS重懸細胞，加RnaseA核酸內(nèi)切酶溶液20μL，37℃水浴30min，離心10min，棄上清，加入熒光染料PI染液400μL，混勻后4℃避光孵育30min，流式細胞儀檢測其結(jié)果；

結(jié)果以表示，其中，x代表均值，s代表標準偏差，采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行配對t檢驗、單因素方差分析，結(jié)果為p＜0.01和p＜0.05有統(tǒng)計學差異，其中，p代表顯著性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹿胎寡肽對巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)的分析方法，其特征是：所述步驟三和步驟四中考馬斯亮藍試劑的調(diào)配方法為，稱取50mg的考馬斯亮藍G-250，以25mL的95％乙醇溶解，再加入50mL的85％磷酸搖勻后，以蒸餾水定容至50mL的棕色瓶內(nèi)，獲得考馬斯亮藍試劑備用。