[發明專利]一種同時檢測青霉和鐮刀菌的微滴數字PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201911098128.5
• 申請日: 2019-11-12
• 公開（公告）號: CN112852988A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 陳穎;趙曉美;王娉;張慶
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/77;C12R1/80
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本發明涉及一種用于同時檢測青霉和鐮刀菌的引物、探針。本發明還涉及用于測定食品中青霉和鐮刀菌的雙重微滴數字PCR檢測方法，所述方法包括使用針對青霉和鐮刀菌檢測的特異性寡核苷酸引物及探針。本發明還涉及用于食品中青霉和鐮刀菌的雙重微滴數字PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括特異性寡核苷酸引物及探針。使用本發明的雙重微滴數字PCR檢測方法，能夠簡單、快速、特異且靈敏地同時檢測青霉和鐮刀菌。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及用于高特異、高靈敏度的快速檢測青霉和鐮刀菌的寡核苷酸引物和探針以及包含所述引物對和探針的雙重微滴數字PCR檢測試劑盒，用于測定青霉和鐮刀菌的雙重微滴數字PCR檢測方法，以及所述引物對和探針或試劑盒在快速檢測青霉和鐮刀菌中的應用。

背景技術

青霉，一般是指青霉屬（Penicillium），和曲霉屬（AsPergillus）有親緣關系，有二百幾十種，代表種是灰綠青霉，從土壤或空氣中很易分離。分枝成帚狀的分生孢子從菌絲體伸向空中，各頂端的小梗產生鏈狀的青綠—褐色的分生孢子，根據分生孢子頂端的膨大與否，與曲霉屬（AsPergillus）相區別。自從弗萊明（A．Fleming，1929）發現特異青霉（Penicillium notatum）產生抑制細菌生長物質青霉素以來，已對該屬菌的很多種進行了研究。特異青霉已被用于制造青霉素，但不具這種機能的種還很多，同時很多青霉甚至產生毒枝菌素。

鐮刀菌為一種重要的植物病原真菌，在自然界中營寄生或腐生生活。到目前為止已鑒定的鐮刀菌有 40 多種，其中以禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）分布最為廣泛且危害嚴重。赤霉病主要分布于氣候溫暖、濕潤的溫帶地區，受生態環境、寄主范圍以及生物因素等影響，鐮刀菌的分布呈現地域性特征。

產毒真菌的分類鑒別一般采用形態學方法，主要按照真菌的形態、生理特點、抗原構造等特征加以區分。但是，常規的形態學檢測方法存在一定的缺陷，如菌的種類較多、形態特征復雜、部分形態特征和生理生化指標隨環境的變化而不穩定、種的水平上鑒別不準確、耗時長等，國內外研究者業已研發出系列以免疫親和柱等前處理產品結合色譜-質譜聯用的多元化毒素精準檢測體系，有效地改善了食品及飼料中真菌毒素的檢測能力。盡管如此，現有儀器法僅靶向于毒素本身，無法在毒素形成前或早期預測樣品產毒潛能，有效前置化干預毒素危害。總體而言，若毒素已能從食品或飼料中檢測出，其污染已十分嚴重，受感染的產品僅能毀滅處置，無法挽回經濟損失及對受污染產品攝入者的危害。因此，提前監測產毒真菌的存在與否對避免潛在毒素危害意義卓著。

本發明基于以數字PCR為基礎的分子生物學技術，以青霉和鐮刀菌的核酸為檢測基礎，青霉的β-微管蛋白編碼區、鐮刀菌LS rRNA序列為靶基因設計引物及探針，利用數字PCR法檢測青霉和鐮刀菌。建立的雙重微滴數字PCR檢測方法，能同時檢測兩種真菌，突破現有儀器法僅靶向于毒素本身，無法在毒素形成前或早期預測樣品產毒潛能，提前監測青霉和鐮刀菌的存在與否，實現有效防控毒素污染和危害，為青霉和鐮刀菌的診斷添加快速、精準的技術手段。

發明內容

本發明的一個目的在于，提供快速檢測青霉和鐮刀菌的特異性寡核苷酸引物及探針。

本發明的另一個目的在于，提供快速測定青霉和鐮刀菌的微滴數字PCR檢測方法。

本發明提供青霉和鐮刀菌的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測食品中青霉和鐮刀菌的應用。

針對上述發明目的，本發明提供以下技術方案：