[發明專利]用于中華絨螯蟹繭蜂病毒PCR檢測的引物對及試劑盒

在審

• 申請號: 201911095969.0
• 申請日: 2019-11-11
• 公開（公告）號: CN110628958A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 貢成良;顧玉超;馮永杰;謝美萍;李鰻蕓;鮑勝華;周陽;薛仁宇;曹廣力;胡小龍;朱敏;張星
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 32257 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 王玉仙

1.一種用于中華絨螯蟹繭蜂病毒PCR檢測的引物對，其特征在于，所述的引物對根據中華絨螯蟹繭蜂病毒特異性序列進行設計。

2.根據權利要求1所述的用于中華絨螯蟹繭蜂病毒PCR檢測的引物對，其特征在于，所述的中華絨螯蟹繭蜂病毒特異性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求2所述的用于中華絨螯蟹繭蜂病毒PCR檢測的引物對，其特征在于，所述的引物對包括：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5’-CACCCACTACAAGGATGTGC-3’；

反向引物(SEQ ID NO.2)：5’-CCTCCATCAAACCTGAAGAACC-3’。

4.根據權利要求1所述的用于中華絨螯蟹繭蜂病毒PCR檢測的引物對，其特征在于，所述的引物對還包括在上述引物對3’端堿基不變，序列中1-3個堿基錯配得到的引物對。

5.一種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含權利要求1-4任一項所述的用于中華絨螯蟹繭蜂病毒PCR檢測的引物對。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包含凍干DNA提取試劑、凍干PCR檢測試劑和對照質粒。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的DNA提取試劑為800-1200mmolTris-HCl、200-300mmol EDTA、4500-5500mmol NaCl、8-12％SDS、8-12％NP40和8000-12000μg/ml蛋白酶K。

8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR檢測試劑為10×PCR緩沖液、4dNTPs Mix、200-300pmol/L引物對、20-30mM MgCl₂、3-8U/μL Taq DNA聚合酶。

9.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的對照質粒含有如SEQ ID NO.3所示的中華絨螯蟹繭蜂病毒特異性序列。

10.一種權利要求5所述的試劑盒檢測中華絨螯蟹繭蜂病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)在組織總DNA提取管中，加0.5-1mL雙蒸水溶解，制備組織總DNA提取液，爾后與0.08-0.12g待檢組織混合，50-60℃保溫0.5-1小時，沸水浴加熱4-6分鐘，離心8-12分鐘，取上清作為DNA模板；

(2)在待檢樣品PCR管中，加20-30μL雙蒸水，溶解后加0.8-1.2μL DNA模板；

(3)在陽性對照PCR管中，加20-30μL雙蒸水溶解；

(4)將步聚2、3的PCR管進行PCR擴增；

(5)PCR反應結束后，取8-10μL反應產物用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收0.3kb的PCR產物，克隆進載體進行測序；所測出的序列與SEQ ID NO.3序列的一致性達到98％以上時可判斷為所檢測樣品中含有中華絨螯蟹繭蜂病毒。