[發明專利]一種花生轉基因的方法

在審

• 申請號: 201911094331.5
• 申請日: 2019-11-11
• 公開（公告）號: CN110699377A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 史剛榮;陳楠楠;王曦;陳思遠;朱兔籃;曹琪琪
• 申請（專利權）人: 淮北師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/65;A01H1/00
• 代理公司: 51241 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 李鵬

本發明公開了一種花生轉基因的方法，包括如下步驟：(1)消毒浸種，(2)切取半粒種子，(3)預培養，(4)農桿菌浸染，(5)共培養，(6)蛭石培養，(7)潮霉素篩選，(8)PCR檢測。本發明直接將共培養花生種子播種在蛭石中成苗，并利用潮霉素水培法篩選陽性植株，避免了組織培養過程中復雜而繁瑣的無菌操作培養以及成苗后的練苗過程。無需特殊的器材、技術和培養條件，操作過程極其簡單。本發明直接對花生半粒種子進行遺傳轉化，大大縮短了遺傳轉化的時間，從浸種到成苗僅需20天。

技術領域

本發明屬于轉基因技術領域，具體涉及一種花生轉基因的方法。

背景技術

花生(Arachis hypogaea L.)是全球第四大油料作物，也是中國重要的經濟和油料作物之一?；ㄉ倪z傳轉化研究起步較晚，由于技術難度較大，進展緩慢。根癌農桿菌介導的基因轉化是利用Ti質粒實現基因的轉移并整合到植物細胞基因組中的天然轉化途徑之一。該轉化系統由于理論機理最清楚、技術方法最成熟，已被廣泛應用于花生轉基因研究。近年來，花生的遺傳轉化研究隨著體細胞再生技術的進步取得了很大進展，已經可以有目的地獲得特定基因的轉化花生植株。但是這些花生轉化系統普遍存在著轉化周期長，篩選難度大，轉化效率低及重復性差的問題。

目前已建立的花生遺傳轉化體系主要是基于組織培養技術，以胚小葉、子葉節、下胚軸、帶子葉的胚軸等作為外植體，但是這些遺傳轉化體系操作復雜、轉化周期長、重復性差。

中國油料作物學報2018，40(2)公開了農桿菌介導的花生遺傳轉化條件優化，該文獻中，為建立花生快速高效的遺傳轉化體系,以浸泡吸水后的花生半粒種子為轉化受體,利用根癌農桿菌介導法,以除草劑Basta抗性篩選及基因組DNA的bar基因PCR檢測為指標,優化花生遺傳轉化體系。研究結果表明,在侵染懸浮液中加入1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)提高了農桿菌介導的轉化效率(最高提升36.5％)；與YEB培養液相比,AB重懸液的使用顯著提高了農桿菌的轉化效率(最高提升19.3％)；農桿菌菌液OD_(600)為0.7時轉化效率最高；基因型顯著影響轉化效率,EXP27-1516的轉化效率為69.03％,顯著高于14AU01(56.67％)；以花生半粒種子為轉化受體,從種子培養到形成茁壯根系僅需8周,明顯短于子葉節轉化所需的13周。優化后的農桿菌介導的花生遺傳轉化體系為花生轉基因研究提供了重要的研究工具。即使如此，由于該方法將半粒種子接種到MS培養基上，因此，需要嚴格的無菌操作，而且成苗后需要練苗。更重要的是，該方法采用的質粒載體為p201B Cas9，僅含有選擇標記基因(對除草劑Basta有抗性的bar基因)，沒有目的基因，其實際應用價值有限。

申請號為2016111395009的中國專利申請公開了利用橫切花生種子快速獲得轉基因花生的方法及其應用，包括以下步驟：1)取處于對數生長期的含有外源基因的農桿菌，重懸于培養基中，得到轉化菌液；2)取成熟的花生種子，浸泡20-30分鐘，萌發0-4天；然后在離胚根0.2-0.5cm處將所述花生種子橫切為兩半，選擇含有胚根的一半，即為轉化受體；3)將所述轉化受體浸泡在轉化菌液中，侵染20-50分鐘，接著取出轉化受體，吸干表面的液體，再置于吸水紙上，于22±2℃暗培養3-4天，得到花生幼苗；培養過程中，向吸水紙上噴施含0.2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤的MS培養基，使得吸水紙保持濕潤；4)將所述花生幼苗繼續培養至得到花生植株，對花生植株進行鑒定，即可確定轉基因植株。該方法共培養后半粒種子成苗培養過程中用的是MS培養基，需要無菌操作，成苗后需要練苗。大大的增加了成本及時間，獲得轉基因植株需要3個月。

發明內容

本發明所要解決的技術問題為：克服現有的花生轉基因技術難度大、培養周期長、轉化效率偏低等缺陷，提供一種快速、簡單、高效且實用的花生轉基因新技術。

本發明的技術方案為：

一種花生轉基因的方法，包括如下步驟：

1.一種花生轉基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：