[發明專利]一種花生轉基因的方法

在審

• 申請號: 201911094331.5
• 申請日: 2019-11-11
• 公開（公告）號: CN110699377A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 史剛榮;陳楠楠;王曦;陳思遠;朱兔籃;曹琪琪
• 申請（專利權）人: 淮北師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/65;A01H1/00
• 代理公司: 51241 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 李鵬

1.一種花生轉基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)消毒浸種：將花生種子先用70％酒精清洗1～2min，再用0.1％升汞清洗5～8min，然后用無菌水清洗3次每次3～5min，最后將花生移至無菌水中浸種24h。

(2)切取半粒種子：在無菌條件下，將經過消毒浸種處理后的花生剝皮，然后將刀插入花生的裂縫中，壓住一片子葉，再用工具夾住另一片子葉將其去除；

(3)預培養：將半粒種子放于MS液體基本培養基中，將其放于25℃、100rpm的搖床中暗培養1～3d；

(4)農桿菌浸染：利用含有潮霉素抗性基因作為選擇標記基因的pCXSN質粒載體構建AhZIP1基因的過表達載體，并轉入農桿菌GV3101中；活化的農桿菌接種于含有20μL卡那霉素，100μL利福平的20mLYEP液體培養基中，于240rpm、28℃搖床震蕩3～4h；搖菌至OD600為0.6～0.9時離心收菌，將重懸好的菌種置于收菌MS中，并加入濃度為150μM的乙酰丁香酮和1mM的二硫蘇糖醇；將步驟(3)處理后的半粒種子移入菌液中，30Hz超聲處理4～10min，然后在真空度為0.06MP的條件下真空處理5～10min；

(5)共培養：將已侵染農桿菌的半粒種子置于含有150μM AS的液體MS培養基中，將其放于25℃、100rpm的搖床中暗培養2～5d；

(6)蛭石培養：完成共培養的半粒種子洗滌后直接播種于蛭石中，在光照條件下進行培養；

(7)潮霉素篩選：待花生長出兩個復葉后，移苗至含30～40％潮霉素的Hoagland營養液中進行篩選；培養3天后，存活的正常植株即為潮霉素抗性植株；

(8)PCR檢測：潮霉素篩選獲得的潛在轉基因陽性植株可進一步移到蛭石中進行培養，待苗長大后，剪取葉片提取DNA，進行PCR檢測鑒定。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)消毒浸種：將花生種子放入錐形瓶中，先用70％酒精清洗1min，再用0.1％升汞清洗6min，然后用無菌水清洗3次每次4min，最后將花生移至無菌水中浸種24h。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)切取半粒種子：在無菌條件下，用消過毒的鑷子將浸泡24h的花生放在帶濾紙的培養皿上，將花生剝皮，將刀插入花生的裂縫中，壓住一片子葉，再用鑷子夾住另一片子葉將其去除。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)預培養：將半粒種子(去掉一片子葉的胚)放于MS液體基本培養基中，將其放于25℃、100rpm的搖床中暗培養2d。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)農桿菌浸染：利用pCXSN質粒載體(含有潮霉素抗性基因作為選擇標記基因)構建AhZIP1基因的過表達載體，并轉入農桿菌GV3101中；活化的農桿菌接種于含有20μL卡那，100μL利福平的20mLYEP液體培養基中，于240rpm、28℃搖床震蕩3-4h；搖菌至OD600＝0.8時離心收菌，將重懸好的菌種置于收菌MS中，并加入濃度為150μM的乙酰丁香酮(AS)和1mM的二硫蘇糖醇(DTT)；將暗培養2d的半粒種子移入菌液中，30Hz超聲處理4min，然后在真空度為0.06MP的條件下真空處理5min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)共培養：將已侵染農桿菌的花生置于含有150μM AS的液體MS培養基中，將其放于25℃、100rpm的搖床中暗培養3d。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(7)潮霉素篩選：待花生長出兩個復葉后，移苗至含35％潮霉素的Hoagland營養液中進行篩選；培養3天后，存活的正常植株即為潮霉素抗性植株。