[發(fā)明專利]重組人源III型膠原蛋白α1鏈及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2019-11-11
• 公開（公告）號: CN110606896B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 錢松;王麗萍
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇悅智生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/78;C12N15/62;C12N15/81;C12N1/19;A61L15/32;A61L15/42;A61K8/65;A61Q19/00;C12R1/84
• 代理公司: 常州智慧騰達專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32328
• 代理人: 曹軍

本發(fā)明公開了一種重組人源III型膠原蛋白α1鏈及其應(yīng)用，編碼該所述重組人源III型膠原蛋白α1鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重組人源III型膠原蛋白α1鏈從氨基端依次包含：氨基端親和純化標簽、人源III型膠原成熟肽鏈以及羧基端親和純化標簽。根據(jù)本發(fā)明實施例的重組人源III型膠原蛋白，通過在人源III型膠原成熟肽鏈的兩端都設(shè)計有特異性親和純化標簽，有利于全長蛋白的純化，也可用于膠原蛋白的鑒定，并且根據(jù)本發(fā)明實施例的所述重組人源III型膠原蛋白采用的是III型膠原蛋白的成熟肽鏈，去除了兩端的前肽，表達量遠高于包含前肽的基因。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種重組人源III型膠原蛋白α1鏈及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

膠原是包括皮膚、骨骼、肌腱和軟骨在內(nèi)的所有結(jié)締組織中的主要蛋白質(zhì)。例如，它在皮膚中形成大的纖維束，每個纖維束又包含許多單個的膠原原纖維，使得皮膚結(jié)構(gòu)強壯且靈活。成熟的三螺旋的膠原蛋白在人體中含量非常豐富，對一系列工業(yè)和醫(yī)學應(yīng)用非常有價值。膠原蛋白已被廣泛應(yīng)用于臨床應(yīng)用領(lǐng)域，其在包括軟性組織擴張、創(chuàng)口和燒傷的修復(fù)、骨科和心血管等方面被證明安全有效。

人類III型膠原蛋白(hCOL3A1)屬于形成纖維的膠原蛋白，廣泛分布于皮膚，內(nèi)臟器官或血管系統(tǒng)等可伸展的結(jié)締組織中。它在人體傷口愈合，膠原纖維形成和心血管正常發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。

膠原蛋白的獲得主要有兩種種途徑，包括來源于動物組織的傳統(tǒng)方法和異源蛋白表達。傳統(tǒng)方法主要通過酸、堿或酶解法來處理動物來源的組織，這些方法獲得的均為長度不等的混合膠原肽段，給純化帶來不便；由于異源膠原蛋白在臨床上表現(xiàn)出的排異反應(yīng)，限制了其作為生物醫(yī)學材料和藥物載體方面的應(yīng)用。目前異源蛋白表達采用的宿主主要包括哺乳動物細胞、動物體、植物和微生物，微生物表達相比其他技術(shù)有著產(chǎn)量高、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)簡單、成本低、易獲取高密度發(fā)酵等優(yōu)點。目前用于重組表達人膠原蛋白或明膠的宿主菌有畢赤酵母、釀酒酵母、漢遜酵母、大腸桿菌與短桿菌。畢赤酵母發(fā)酵表達產(chǎn)率高、培養(yǎng)基簡單、表達蛋白穩(wěn)定且易于純化，蛋白具有后修飾如糖基化等能力。使用畢赤酵母異源表達膠原蛋白具有較大優(yōu)勢。

現(xiàn)有技術(shù)中用于工業(yè)生產(chǎn)的多為明膠，未見膠原蛋白成熟肽鏈大規(guī)模生產(chǎn)。DavidR.Olsen等的研究表明I型膠原的基因中不含兩端前肽基因時，表達量分別為原膠原的18倍、缺乏N前肽基因的4.6倍和缺乏C前肽基因的3倍。且用于生產(chǎn)的重組表達人源膠原，通常不添加或只在一端添加親和標簽，而表達出的成熟肽鏈較易降解，經(jīng)傳統(tǒng)非特異性純化方法或單一親和標簽純化獲得的蛋白純度不夠，難以去除部分降解產(chǎn)物，無法滿足對純度要求高的應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)中利用微生物獲得膠原蛋白還存在以下不足之處：表達膠原的DNA序列均為人基因組中的天然編碼序列(一般通過反轉(zhuǎn)錄方法獲得)，但微生物與人在基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中有著一定的差別，尤其是密碼子的偏好性上有所不同，使用人膠原的天然編碼DNA序列在微生物中表達，會因密碼子偏好性、mRNA的結(jié)構(gòu)等造成翻譯表達效率低下。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決上述技術(shù)問題之一。

為此，本發(fā)明提出一種重組人源III型膠原蛋白α1鏈，該重組人源III型膠原蛋白α1鏈純化和鑒定方便。

本發(fā)明還提出一種重組人源III型膠原蛋白α1鏈的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明第一方面實施例的重組人源III型膠原蛋白α1鏈，編碼該所述重組人源III型膠原蛋白α1鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重組人源III型膠原蛋白α1鏈從氨基端依次包含：氨基端親和純化標簽、人源III型膠原成熟肽鏈以及羧基端親和純化標簽。

根據(jù)本發(fā)明上述實施例的重組人源III型膠原蛋白α1鏈，還可以具有如下的附加技術(shù)特征

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述氨基端親和純化標簽為6His標簽，所述羧基端親和純化標簽為Strep標簽。