[發(fā)明專利]高效表達豬CRTC3的質(zhì)粒及腺病毒的構(gòu)建方法及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911092005.0
• 申請日: 2019-11-11
• 公開（公告）號: CN110863010B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 單體中;劉嘉琪;汪以真
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/65;C12N7/01
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明公開了一種豬CRTC3高效表達載體pAdM?FH?GFP?CRTC3的構(gòu)建方法，包括以下步驟：豬CRTC3序列的克隆；AdM?FH?GFP腺病毒載體的構(gòu)建；插入pAdM?FH?GFP腺病毒載體多克隆位點的豬CRTC3基因；pAdM?FH?GFP腺病毒包裝。本發(fā)明還同時公開了上述豬CRTC3高效表達載體的用途：用于研究示蹤豬CRTC3在不同細胞中的定位，構(gòu)建好的pAdM?FH?GFP?CRTC3轉(zhuǎn)染到293T細胞、豬皮下脂肪細胞后，熒光顯微鏡下觀察到CRTC3亞細胞定位。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高效表達豬CRTC3(cAMP responsive element bindingregulated transcription coactivators)的pAdM-FH-GFP-CRTC3質(zhì)粒、腺病毒及其構(gòu)建方法和用途，屬于生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)。

背景技術(shù)

能量代謝是一個從外界攝取營養(yǎng)物質(zhì)到體內(nèi)細胞分解利用的過程，其中cAMP參與調(diào)節(jié)細胞能量轉(zhuǎn)換和利用，對機體的生命活動起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，cAMP-PKA介導(dǎo)的信號通路通過cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB及其協(xié)同激活子CRTC共同作用調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活因子3(CRTC3)是CRTC家族中的一員，在脂肪組織中高度表達，通過調(diào)控脂肪組織里的兒茶酚酞信號通路來影響脂肪的代謝和促進肥胖的產(chǎn)生。在白色脂肪細胞中，CRTC3受到鹽誘導(dǎo)激酶2(SIK2)的調(diào)控，參與了脂肪細胞的葡萄糖攝取調(diào)控過程。在棕色脂肪細胞中，CRTC3與C/EBPβ結(jié)合調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性來促進棕色脂肪相關(guān)基因解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)等表達。在骨骼肌中，CRTC3的過表達增加了肌內(nèi)甘油三酯并調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈蛋白的合成，促進了脂肪中的脂質(zhì)沉積。因此，CRTC3是一個重要的糖脂代謝調(diào)控基因，維持代謝的穩(wěn)態(tài)。

目前研究集中在鼠CRTC3的基因功能，關(guān)于豬CRTC3的基因全長還未見報道，對豬CRTC3的基因功能研究甚少。最近研究也發(fā)現(xiàn)，在豬上，CRTC3可能與肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)。因此，豬CRTC3基因全長序列克隆及構(gòu)建高效表達豬CRTC3的質(zhì)粒、腺病毒研究具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供豬CRTC3基因全長序列和構(gòu)建豬CRTC3高效表達的質(zhì)粒、腺病毒的研究方法建立，以及該方法的用途。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種豬CRTC3高效表達載體(pAdM-FH-GFP-CRTC3，即，帶GFP熒光報告基團的CRTC3表達載體)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

豬CRTC3序列的克隆；

pAdM-FH-GFP腺病毒載體的構(gòu)建；

插入pAdM-FH-GFP腺病毒載體多克隆位點的豬CRTC3基因。

作為本發(fā)明的豬CRTC3高效表達載體的構(gòu)建方法的改進，還包括以下步驟：pAdM-FH-GFP腺病毒包裝。

作為本發(fā)明的豬CRTC3高效表達載體的構(gòu)建方法的進一步改進，豬CRTC3序列克隆為：根據(jù)NCBI上的豬CRTC3預(yù)測序列，設(shè)計特異性引物Adaptor1、Adaptor2和CRTC3-1、CRTC3-2，采用3'RACE方法得到序列(含TGA終止密碼子)。

作為本發(fā)明的豬CRTC3高效表達載體的構(gòu)建方法的進一步改進：

設(shè)3對特異性引物CRTC3-F1、CRTC3-R1、CRTC3-F2、CRTC3-R2、CRTC3-F3、CRTC3-R3，得到CRTC3基因片段后與3'RACE序列進行拼接，得到豬CRTC3基因全長序列。

作為本發(fā)明的豬CRTC3高效表達載體的構(gòu)建方法的進一步改進：根據(jù)pAdM-FH-GFP載體的信息和豬CRTC3全長基因序列，同時根據(jù)pAdM-FH-GFP載體上的AsisI和MluI酶切位點，構(gòu)建豬pAdM-FH-GFP-CRTC3表達載體。