[發明專利]高效表達豬CRTC3的質粒及腺病毒的構建方法及其用途

有效

• 申請號: 201911092005.0
• 申請日: 2019-11-11
• 公開（公告）號: CN110863010B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 單體中;劉嘉琪;汪以真
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/65;C12N7/01
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.豬CRTC3高效表達載體pAdM-FH-GFP-CRTC3的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

豬CRTC3序列的克隆；

pAdM-FH-GFP腺病毒載體的構建；

插入pAdM-FH-GFP腺病毒載體多克隆位點的豬CRTC3基因。

2.根據權利要求1所述的豬CRTC3高效表達載體的構建方法，其特征在于還包括以下步驟： pAdM-FH-GFP腺病毒包裝。

3. 根據權利要求1或2所述的豬CRTC3高效表達載體的構建方法，其特征在于豬CRTC3序列克隆為：根據NCBI上的豬CRTC3預測序列，設計特異性引物Adaptor1、Adaptor2和CRTC3-1、CRTC3-2，采用3'RACE方法得到序列；

Adaptor1：5-cGAAAGCGACAAGGCCGTGATCCCGAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTVN-3

Adaptor2：5-cGAAAGCGACAAGGCCGTGATCCCGAAAGC-3

CRTC3-1：5-GCCACAGGACTCCTTTCATTTG-3

CRTC3-2：5-CACCAGCCTGACAGAAGACTCG-3。

4.根據權利要求3所述的豬CRTC3高效表達載體的構建方法，其特征在于：

設3對特異性引物CRTC3-F1、CRTC3-R1、CRTC3-F2、CRTC3-R2、CRTC3-F3、CRTC3-R3，得到CRTC3基因片段后與3'RACE序列進行拼接，得到豬CRTC3基因全長序列；

CRTC3-F1：ATGGCTGCTTCGCCCGG

CRTC3-R1：GGTGCTTCTCTTCCTTCCAA

CRTC3-F2：TGGAGCTACTTATGCTTCGC

CRTC3-R2：CTGTCTGCTGAAACCTTGATG

CRTC3-F3：TTCCTCTTCCCTCAATAGCCA

CRTC3-R3：AAGTGATTCCAGCATGGGC。

5. 根據權利要求4所述的豬CRTC3高效表達載體的構建方法，其特征是：根據pAdM-FH-GFP載體的信息和豬CRTC3全長基因序列，同時根據pAdM-FH-GFP載體上的AsisI 和MluI酶切位點，構建豬pAdM-FH-GFP-CRTC3表達載體。

6. 如權利要求1~5任一項方法構建所得的豬CRTC3高效表達載體pAdM-FH-GFP-CRTC3的鑒定方法，其特征是：設置對照組pAdM-FH-GFP，通過抗生素篩選，采用Western blot、熒光定量PCR和測序鑒定，熒光定量PCR反應的引物為qCRTC3-F和qCRTC3-R；測序引物為：CMV-F 和BGH引物；

qCRTC3-F ：GACAAGCCAGGACGACAGTT

qCRTC3-R：GGTGCTTCTCTTCCTTCCAA

CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG。

7.如權利要求1~5任一項方法構建所得的豬CRTC3高效表達載體pAdM-FH-GFP-CRTC3的鑒定方法，其特征是：用于研究示蹤豬CRTC3在不同細胞中的定位，構建好的pAdM-FH-GFP-CRTC3轉染到293T細胞、豬皮下脂肪細胞后，熒光顯微鏡下觀察到CRTC3亞細胞定位。

8.根據權利要求7所述的用途，其特征是包括以下步驟：pAdM-FH-GFP-CRTC3轉染到豬皮下脂肪細胞的促進脂滴生成的功能及相關調控研究。