[發明專利]一種遞送siRNA的外泌體的制備方法

在審

• 申請號: 201911090177.4
• 申請日: 2019-11-08
• 公開（公告）號: CN110699382A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 趙凱
• 申請（專利權）人: 趙凱
• 主分類號: C12N15/88
• 分類號: C12N15/88;C12N5/078
• 代理公司: 11833 北京化育知識產權代理有限公司
• 代理人: 尹均利

1.一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、制備上清液：先取出于-80℃儲存的血漿置于37℃水浴中，完全液態后將其置于冰上；然后經2000×g離心20-30min去除細胞和碎片，再用移液槍吸取上清液至新的離心管內，再經10000×g離心20-30min；最后將所得上清液吸取至新的離心管內，并將其放置在冰上直至開始分離；

S2、分離外泌體：將S1中開始分離的上清液吸取適當體積至新的離心管中，加入0.5×上清液體積的PBS后進行渦旋混勻；然后加入0.2×(上清液體積+PBS體積)的外泌體沉淀試劑，渦旋混勻后所得記為混合物；將所述混合物在室溫下孵育10-15min后，于室溫下10000×g離心5-10min，棄去上清液后所得顆粒即為外泌體；

S3、外泌體的表征分析：對S2中得到的外泌體進行分析，所述分析包括以下步驟：

a、用納米顆粒跟蹤分析儀來表征外泌體大小和產量；

b、用顆粒蛋白比測定法表征外泌體純度；

c、采用流式細胞術檢測外泌體標志物表達的特征；

d、使用透射電子顯微鏡表征外泌體形態；

S4、封裝siRNA至外泌體內：通過電穿孔將siRNA封裝到經過S3表征分析后的外泌體中，所得記為混合物；

S5、去除游離siRNA：采用粒度排除色譜法去除所述混合物中游離的siRNA，所得即為封裝有siRNA的外泌體。

2.根據權利要求1所述的一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，所述S1中離心在室溫條件下進行。

3.根據權利要求1所述的一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，所述S2中PBS優選為1×PBS緩沖液。

4.根據權利要求1所述的一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，所述S3中在外泌體的表征分析過程中，需要對分析結果進行記錄。

5.根據權利要求1所述的一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，所述S4中封裝siRNA至外泌體內的具體操作步驟為：

1)先在冰上預冷電穿孔環30min，再按照1：60的摩爾比將外泌體和siRNA混合在微型離心管中，然后加入適量的檸檬酸緩沖液進行混合，所得記為預混合物；

2)將1)中的預混合物轉移至電穿孔試管中進行電穿孔，電穿孔結束后所得即為混合物，并用移液管從試管中取出混合物進行下一步處理。

6.根據權利要求1所述的一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，其特征在于，所述S5中去除游離siRNA的具體操作步驟為：

1)先通過兩次過濾350μLPBS來平衡SEC柱，再取150μL所述混合物溶解在350μL過濾過的PBS中，并將其轉移至SEC柱內進行游離siRNA去除，然后收集從SEC柱中洗脫的前500μL組分；

2)再次向SEC柱中加入500μL過濾后的PBS，并收集接下來的500μL組分；

3)重復步驟2)，直到收集到10×500μL的總份數，此時能夠對混合物中游離的siRNA進行去除，得到封裝有siRNA的外泌體。