[發明專利]一種遞送siRNA的外泌體的制備方法

在審

• 申請號: 201911090177.4
• 申請日: 2019-11-08
• 公開（公告）號: CN110699382A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 趙凱
• 申請（專利權）人: 趙凱
• 主分類號: C12N15/88
• 分類號: C12N15/88;C12N5/078
• 代理公司: 11833 北京化育知識產權代理有限公司
• 代理人: 尹均利

本發明涉及外泌體遞送siRNA技術領域，提供一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，本發明在準備上清液的過程中將于?80℃儲存的血漿置于37℃水浴中，能夠對冰凍的血漿進行融化，使其完全液態；然后通過沉淀試劑法對外泌體和血漿進行分離，并且通過離心的方式將外泌體和死亡細胞及其碎片進行去除，從而得到外泌體；然后分別分析外泌體的大小、產量、純度、形態和標志物表達的特征，從而能夠對所分離出的外泌體的特征進行表征分析，為后續封裝siRNA至外泌體內的步驟做鋪墊；最后通過電穿孔法將siRNA封裝至所分離出的外泌體內，并通過粒度排除色譜法對游離的siRNA進行去除，從而能夠得到純度較高的封裝有siRNA的外泌體，進而提高外泌體遞送siRNA的效率。

技術領域

本發明涉及外泌體遞送siRNA技術領域，具體涉及一種遞送siRNA的外泌體的制備方法。

背景技術

外泌體是天然的囊泡結構，真有得天獨厚的生物相容性，其本身內部就含有核酸和蛋白，故近年來將外泌體作為遞送系統是一個很熱的研究方向。細胞外囊泡，特別是外泌體，由于其生物學起源、豐富性和內在的能力，近年來作為新型藥物傳遞載體受到關注。siRNA為小干擾RNA，能夠引起RNA干擾，其中RNA干擾是對基因轉錄后的表達過程進行特異性的抑制從而達到基因沉默的目的；而且外泌體作為載體，能夠實現對siRNA進行遞送。siRNA可以通過電穿孔成功地裝載到外泌體中，然后使外泌體在體外傳遞到癌細胞中，該方案提供了一個標準的程序，開發裝載siRNA的外泌體，以有效地傳遞到癌細胞內。

發明內容

解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，旨在能夠開發裝載siRNA的外泌體，從而將siRNA有效地傳遞到癌細胞內。

技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：

一種遞送siRNA的外泌體的制備方法，包括以下步驟：

S1、制備上清液：先取出于-80℃儲存的血漿置于37℃水浴中，完全液態后將其置于冰上；然后經2000×g離心20-30min去除細胞和碎片，再用移液槍吸取上清液至新的離心管內，再經10000×g離心20-30min；最后將所得上清液吸取至新的離心管內，并將其放置在冰上直至開始分離；

S2、分離外泌體：將S1中開始分離的上清液吸取適當體積至新的離心管中，加入0.5×上清液體積的PBS后進行渦旋混勻；然后加入0.2×(上清液體積+PBS體積)的外泌體沉淀試劑，渦旋混勻后所得記為混合物；將所述混合物在室溫下孵育10-15min后，于室溫下10000×g離心5-10min，棄去上清液后所得顆粒即為外泌體；

S3、外泌體的表征分析：對S2中得到的外泌體進行分析，所述分析包括以下步驟：

a、用納米顆粒跟蹤分析儀來表征外泌體大小和產量；

b、用顆粒蛋白比測定法表征外泌體純度；

c、采用流式細胞術檢測外泌體標志物表達的特征；

d、使用透射電子顯微鏡表征外泌體形態；

S4、封裝siRNA至外泌體內：通過電穿孔將siRNA封裝到經過S3表征分析后的外泌體中，所得記為混合物；

S5、去除游離siRNA：采用粒度排除色譜法去除所述混合物中游離的siRNA，所得即為封裝有siRNA的外泌體。

更進一步地，所述S1中離心在室溫條件下進行。

更進一步地，所述S2中PBS優選為1×PBS緩沖液。

更進一步地，所述S3中在外泌體的表征分析過程中，需要對分析結果進行記錄。