[發明專利]一種應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒

在審

• 申請號: 201911088231.1
• 申請日: 2019-11-08
• 公開（公告）號: CN110669843A
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 金鑫浩;劉一博;隋碩;任魯風;張未來;俞育德;于軍
• 申請（專利權）人: 寧波胤瑞生物醫學儀器有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 11470 北京精金石知識產權代理有限公司
• 代理人: 劉俊玲

1.一種應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括引物探針預混液，所述引物探針預混液中包括1)檢測HER2基因的上下游引物、檢測HER2基因的熒光探針；2)檢測人FAS基因的上下游引物、檢測人FAS基因的熒光探針；3)檢測人ACTB基因的上下游引物、檢測人ACTB基因的熒光探針；

其中，1)HER2基因的引物、探針包括如下序列：

上游引物：5'-ACTTAATTGGCATTCTACTCCC-3'SEQ ID NO:1；

下游引物：5'-ATTGGAGACACGGCCTC-3'SEQ ID NO:2；

探針：5'-GGCGCAACGCTGAGCAGCTGG-3'SEQ ID NO:3；

2)檢測人FAS基因的上下游引物、探針包括如下序列：

上游引物：5'-CGCTTATATAATGGTGCTCGTT-3'SEQ ID NO:4

下游引物：5'-TATCAGGACAAACTAAATCCCC-3'SEQ ID NO:5

探針：5'-AAGCCTGCAGATACAAGGACAC-3'SEQ ID NO:6

3)檢測人ACTB基因的上下游引物、探針包括如下序列：

上游引物：5'-CGCCCTTTCTCACTGGTTC-3'SEQ ID NO:7

下游引物：5'-TAGTACCTACACCCACAACAC-3'SEQ ID NO:8

探針：5'-CTCTTCTGCCGTTTTCCGTAGG-3'SEQ ID NO:9。

2.根據權利要求1所述的應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，還包括PCR反應預混液,所述PCR反應預混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP、鎂離子、BSA、熱啟動Taq酶和擴增增強劑。

3.根據權利要求2所述的應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述擴增強劑包括焦磷酸酶和Triton X-100。

4.根據權利要求3所述的應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述焦磷酸酶的終濃度為0.5-2U，所述Triton X-100的終濃度為0.05％-2％。

5.根據權利要求2所述的應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應預混液包括

6.根據權利要求1-5中任一項所述的應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，用于檢測HER2、FAS和ACTB基因的上游引物、下游引物和熒光探針的工作濃度均為0.1-1μM。

7.根據權利要求1-5中任一項所述的應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，所述HER2基團的熒光報告基團為CY3，熒光淬滅基團為BHQ2；FAS基團的熒光報告基團為FAM，熒光淬滅基團為BHQ1；ACTB的熒光報告基團為HEX，熒光淬滅基團為BHQ1。

8.根據權利要求1-5中任一項所述的應用數字PCR檢測HER2基因擴增的試劑盒，其特征在于，還包括陰性質控品和陽性質控品,所述陰性質控品為經免疫組化方法和PCR方法證明為HER2擴增陰性的乳腺癌組織DNA；

陽性質控品為經免疫組化方法和PCR方法證明為HER2擴增陽性的乳腺癌組織DNA。

9.采用如權利要求1-8任一項所述的試劑盒對HER2基因擴增進行檢測的方法，其包括如下步驟：

S1針對選定的HER2、FAS和ACTB序列，分別設計特異性引物和探針；

S2提取檢測樣本的DNA；

S3利用數字PCR平臺進行擴增反應；

S4對擴增結果進行分析與判讀。

10.根據權利要求9所述的方法，其還包括S5對檢測結果判讀分析，具體如下：

HER2與ACTB基因結果分析：

1)如果HER2基因和ACTB內參基因檢測濃度至少一項小于10copies/μL，則檢測結果無效，應重新提取樣本核酸進行檢測；

2)如果HER2基因和ACTB內參基因檢測濃度均在1×10²copies/μL-1×10⁵copies/μL之間，直接進行如下計算：

M＝HER2基因檢測濃度/ACTB內參基因檢測濃度，

當M≤0.2時，則結果判讀為：無HER2基因擴增；

當M＞0.2時，則結果判讀為：HER2基因擴增；

3)如果HER2基因和ACTB內參基因檢測濃度至少一項大于1×10⁵copies/μL，則需要將待檢樣品稀釋至線性范圍內重新測定，并根據(2)的標準判斷結果；HER2與FAS基因結果分析：

1)如果HER2基因和FAS內參基因檢測濃度至少一項小于10copies/μL，則檢測結果無效，應重新提取樣本核酸進行檢測；

2)如果HER2基因和FAS內參基因檢測濃度均在1×10²copies/μL-1×10⁵copies/μL之間，直接進行如下計算：

N＝HER2基因檢測濃度/FAS內參基因檢測濃度，

當N≤2時，則結果判讀為：無HER2基因擴增；

當N＞2時，則結果判讀為：HER2基因擴增；

如果HER2基因和ACTB內參基因檢測濃度至少一項大于1×10⁵copies/μL，則需要將待檢樣品稀釋至線性范圍內重新測定，并根據(2)的標準判斷結果。