[發明專利]用于鯉魚線粒體DNA片段擴增的引物組合及其應用

在審

• 申請號: 201911087606.2
• 申請日: 2019-11-08
• 公開（公告）號: CN110846381A
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 董傳舉;姜洲;張猛;王良炎;李學軍;孔勝楠
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 卞靜靜

1.一種用于鯉魚線粒體DNA片段擴增的引物組合，其特征在于，包括19組引物對，該19組引物對的序列依次為：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一組引物對，如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的第二組引物對，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第三組引物對，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的第四組引物對，如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的第五組引物對，如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的第六組引物對，如SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14所示的第七組引物對，如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的第八組引物對，如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的第九組引物對，如SEQ ID NO:19和SEQID NO:20所示的第十組引物對，如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的第十一組引物對，如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的第十二組引物對，如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示的第十三組引物對，如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的第十四組引物對，如SEQID NO:29和SEQ ID NO:30所示的第十五組引物對，如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的第十六組引物對，如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的第十七路組引物對，如SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36所示的第十八組引物對和如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的第十九組引物對，其中，后一組引物對中的上游引物與線粒體DNA互補的位置位于前一組引物對的下游引物與線粒體DNA互補位置的上游。

2.如權利要求1所述的用于鯉魚線粒體DNA片段擴增的引物組合，其特征在于，所述19組引物對分別應用于聚合酶鏈式反應中。

3.如權利要求2所述的用于鯉魚線粒體DNA片段擴增的引物組合，其特征在于，聚合酶鏈式反應中，鯉魚樣本的模板為鯉魚總DNA。

4.如權利要求3所述的用于鯉魚線粒體DNA片段擴增的引物組合，其特征在于，所述鯉魚樣本的品種為福瑞鯉、黃河鯉、錦鯉或荷包紅鯉。

5.一種利用權利要求1所述的引物組合獲取到鯉魚線粒體DNA序列信息的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)獲得待測鯉魚樣本的總DNA；

2)以步驟1)提取的總DNA為模板，分別采用所述引物組合中的引物對進行聚合酶鏈式反應，獲得擴增產物；

3)對擴增產物進行測序，之后據所述擴增結果獲得序列信息。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中，進行聚合酶鏈式反應時，50mL反應體系中包含：DNA聚合酶2個單位，10×聚合酶緩沖液5μL，25mmol/L的MgCl₂ 5μL，10mmol/L的dNTP 1μL，10μmol/L的引物對各2μL，模板DNA 100～1000μg。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中，聚合酶鏈式反應結束后，將所述擴增產物在666.61-1333.22Pa以下范圍的接近真空狀態和72℃條件下處理10～20min，然后再至于0～4℃進行保存。

8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟1)中，獲得待測鯉魚樣本的總DNA的具體方法包括如下步驟：

步驟一、剪取鯉魚的鰭條，保存于無水乙醇中；

步驟二、用STE緩沖液將鰭條泡洗5h以上，去除無水乙醇，然后取約0.2g鰭條、剪碎，加入0.5mL STE緩沖液、10mg/mL的蛋白酶K15和質量體積比10％的SDS 40μL于50℃水浴4～6h，最后去除蛋白得到所述總DNA。

9.如權利要求1所述的用于鯉魚線粒體DNA片段擴增的引物組合于科學研究中的應用。