[發明專利]用于體外擴增和活化自然殺傷細胞的細胞培養基

有效

• 申請號: 201911086579.7
• 申請日: 2019-11-08
• 公開（公告）號: CN112779215B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 張順浪;林杰良;楊智雅
• 申請（專利權）人: 基亞生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶啟長;韋東

本發明涉及一種用于體外擴增和活化自然殺傷細胞的培養基，該培養基包含納豆激酶，專屬針對自然殺傷細胞提供優化的培養環境，且在不使用癌飼養細胞共同培養的條件下，使用該培養基可有效提升細胞擴增倍數，并產生高純度及對癌細胞具有高度毒殺活性的自然殺傷細胞。

技術領域

本發明涉及一種用于體外擴增和活化自然殺傷細胞的細胞培養基。

背景技術

自然殺傷細胞(Natural Killer Cells；NK細胞)是一群具備CD3^-CD56⁺表達型的細胞，通常存在于淋巴結、各器官及外周血液中。NK細胞在人體外周血液淋巴細胞中約占5～20％，因此外周血液是NK細胞方便的來源之一。NK細胞在1970年代被發現具有毒殺癌細胞的特性，且事先不需要經過教育或致敏(Priming)的過程。之后研究發現，NK細胞除了可以毒殺癌細胞之外，還可以殺死病毒感染的細胞、癌化的細胞及老化應激細胞(StressedCells)。

過去的研究已顯示NK細胞具有治療腫瘤的潛力。自體NK細胞治療癌癥的做法，是將病人外周血液的NK細胞分離后，以體外細胞擴增和活化技術培養約14天，再輸注入該病人體內以達到治療癌癥的效果。過去實施體外細胞擴增和活化方法時，多數將NK細胞與癌飼養細胞(Cancer feeder cell)共同培養，以達到大幅提高NK細胞數量的目的。但使用癌飼養細胞的擴增方法仍無法解決安全性的問題。在將擴增后自然殺傷細胞輸注病人體內前，難以確定癌飼養細胞是否已完全去除，因此產生安全性的疑慮。再者，即使體外培養后NK細胞數量有大幅提升，若該NK細胞毒殺癌細胞的活性不佳，后續應用于自體細胞療法的效果仍非常有限。據此，有必要開發一種培養基，在不使用癌飼養細胞共同培養的條件下，使用該培養基能有效率地提升NK細胞擴增倍數，并產生高純度及高癌細胞毒殺活性的NK細胞。

納豆激酶(nattokinase)是納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis natto)所分泌的胞外酶，已知具有溶解血栓的活性及分解纖維蛋白的功能，可應用于心血管疾病的預防及治療。納豆激酶目前系以口服給予，以營養補充品的形式使用。盡管已有研究探討對象食用納豆或納豆萃取物，有助于調節對象的免疫力(Takeda et al.,TraditionalKampoMedicine,Vol.3Iss.2 100-106,2016)，但其作用的有效成分及相關機制目前仍不清楚。此外，納豆激酶應用于體外免疫細胞培養方法與效用，目前未有相關研究。

發明內容

本發明于一方面，提供一種用于體外擴增和活化自然殺傷細胞的培養基，該培養基包含濃度范圍為5FU/ml至20FU/ml的納豆激酶。

本發明于另一方面，提供一種用于體外擴增和活化自然殺傷細胞的培養基，該培養基更包含輔酶Q10。

于本發明的一些具體實施方面，該培養基包含濃度為100nM至1000nM的輔酶Q10。

本發明于另一方面，提供一種用于體外擴增和活化自然殺傷細胞的培養基，該培養基還包含白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)以及白介素-18(IL-18)；其中該白介素-2(IL-2)于該培養基中的濃度為200～1000IU/ml；其中該白介素-12(IL-12)于該培養基中的濃度為10～50ng/ml；其中該白介素-18(IL-18)于該培養基中的濃度為100～200ng/ml。

本發明于另一方面，提供一種用于體外擴增和活化自然殺傷細胞的培養基，該培養基更包含基礎培養基；其中該基礎培養基為AIM V、X-VIV015、CellGro SCGM、KBM 501、DMEM或RPM1-1640培養基。

在本發明一些具體實施方面，以前述培養基培養后的細胞中，21％至41％是NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞。