[發明專利]一種鑒別冬蟲夏草及其商品真偽PCR引物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201911082647.2
• 申請日: 2019-11-07
• 公開（公告）號: CN110894537B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 周華;程春松;崔顥;裴文菡
• 申請（專利權）人: 澳門科技大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭晨鳴

本發明公開了一種鑒別冬蟲夏草及其商品真偽PCR引物、試劑盒及方法。本發明首次使用含一定酚酞的NaOH溶液實現了微量樣品的DNA提取，使得提取時間從4～8個小時縮短到1分鐘。而且根據不同冬蟲夏草及其替代品多種單倍型的ITS序列特征進行引物的設計，結合PCR使得本發明靈敏度高，特異性強，適合冬蟲夏草及其替代品樣品的檢測，具有極高的應用價值。

技術領域

本發明屬于核酸檢測領域，涉及一種鑒別冬蟲夏草及其商品真偽PCR引物、試劑盒及方法。

背景技術

冬蟲夏草(Ophiocordyceps?sinensis)又稱蟲草。作為名貴藥材的一種，深受老百姓推崇。近30年來，由于自然環境的惡化、開發過度等原因，野生資源越來越少，相應的替代品如蛹蟲草(也稱北蟲草)被開發出來，且廣為應用。另外，蟲草價格不菲，其偽品如涼山蟲草Cordyceps?liangshanensi、亞香棒蟲草Cordyceps?hawresii?Gray、新疆蟲草Cordycepssp.與蟲草外觀十分類似，也曾一度擾亂蟲草市場。蟲草化學鑒別指針單一、分析困難、步驟繁雜、代價高，故而很多替代品摻到蟲草的粉末、制劑等其他類型的加工品中，如地蝅Stacbys?geobombycis、僵蝅Beauveria?bassiana、金蟬花Cordyceps?sobolifera等等。

大量報道顯示，中藥材DNA的特定片段(如ITS序列)的特異性擴增或者直接測序可以有效鑒別冬蟲夏草來源的商品，且基于PCR目標條帶擴增的方法被認為是目前最為有效的藥材基源鑒別方法。然而，現有市售的冬蟲夏草鑒定試劑盒所使用的分子鑒定方法存在著嚴重的檢測弊端和鑒定風險。

首先，現有分子鑒定方法中的DNA提取技術，均采用傳統的CTAB法或者SDS提取法，或者基于傳統DNA提取方法的在核酸沉淀、純化過程中稍作改進的CTAB法。這種DNA提取法的最大負面特點就是耗時長、提取樣品用量大；其次，所報道的分子鑒定方法或者鑒定試劑盒均采用真菌類藥材通用引物進核糖體ITS序列的擴增，而由于測試樣品表面或基質內常常攜帶很多內源性或外源性引入的多種真菌、霉菌等污染，因此通用引物擴增結果則很容易出現假陽性的結果。

由于冬蟲夏草廣泛地分布于青藏高原及橫斷山脈西南面，不同海拔和緯度的生態環境孕育出了超過10多種基因單倍型的種群。故通用的PCR引物擴增的條帶不僅容易出現污染物的假陽性，直接測序的結果也往往會因為多種單倍型的雜合嚴重影響測序的結果。另外，傳統的DNA提取方法在現代中藥材制劑，如口服液、顆粒劑、片劑等的應用上往往受到嚴峻的挑戰，市售的冬蟲夏草商品包含了多種形式的現代制劑。因此常規檢測中，DNA提取的質量和產品均受到嚴重的挑戰，實驗人員往往花費大量時間、多次重復以及大量的樣品進行檢測，但仍然達不到PCR的檢測要求。

綜上所述，開發一種更為高效、穩定、廉價的冬蟲夏草藥材分子鑒定方法成為亟需解決的問題，以適應市場及質檢部門的檢測需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速高效的DNA提取方法，旨在解決中藥或食品檢測領域常常由于樣品類型、劑型繁多、添加輔料復雜而導致的DNA提取困難，并設計特異性的引物實現真菌類藥材冬蟲夏草及其商品的PCR分子鑒定。

本發明所采取的技術方案是：

一種檢測冬蟲夏草PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：

????

一種鑒別冬蟲夏草真偽的PCR試劑盒，該試劑盒含有上面所述的引物。

一種鑒別冬蟲夏草真偽的PCR方法，包括以下步驟：

1)從樣品中提取DNA；

2)以提取的DNA為模板，用上面所述的引物對進行PCR擴增反應；

3)根據電泳條帶的分布情況或添加染料，確定待測樣品中冬蟲夏草的真偽。