[發明專利]多重PCR檢測人魚共患病病原菌的方法

有效

• 申請號: 201911074865.1
• 申請日: 2019-11-06
• 公開（公告）號: CN110724752B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 夏洪麗;魯義善;程俊;夏立群;喻大鵬;陳文捷;龍夢;樊慧敏
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學深圳研究院;深圳義海生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/63;C12R1/01;C12R1/46
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理有限公司 11562
• 代理人: 杜權

1.一種非疾病診斷目的的多重PCR檢測人魚共患病病原菌的方法，包括：

提取溶藻弧菌、類志賀毗鄰單胞菌、副溶血弧菌、無乳鏈球菌、霍亂弧菌、創傷弧菌的基因組DNA；

對病原菌的基因組DNA進行引物設計，引物如下：

溶藻弧菌上游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.1所示，

溶藻弧菌下游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.2所示，

類志賀毗鄰單胞菌上游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.3所示，

類志賀毗鄰單胞菌下游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.4所示，

副溶血弧菌上游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.5所示，

副溶血弧菌下游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.6所示，

無乳鏈球菌上游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.7所示，

無乳鏈球菌下游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.8所示，

霍亂弧菌上游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.9所示，

霍亂弧菌下游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.10所示，

創傷弧菌上游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.11所示，

創傷弧菌下游引物，核苷酸序列如SEDIDNO.12所示；

利用上述引物和PCR方法同時對溶藻弧菌、類志賀毗鄰單胞菌、副溶血弧菌、無乳鏈球菌、霍亂弧菌、創傷弧菌的基因組DNA進行擴增和檢測；

其中，上述引物分別以溶藻弧菌的collagenase基因、類志賀毗鄰單胞菌的hugA基因、副溶血弧菌的tlh基因、無乳鏈球菌的cfb基因、霍亂弧菌的OmpW基因、創傷弧菌的vvhA1基因為靶基因而設計。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PCR方法的反應體系為：

2×TaqPCRMasterMix25μL，10μmol/L；

溶藻弧菌上下游引物均為0.2μL，10μmol/L，

類志賀毗鄰單胞菌上下游引物均為0.4μL，10μmol/L，

副溶血弧菌上下游引物均為0.1μL，10μmol/L，

無乳鏈球菌上下游引物均為0.2μL，10μmol/L，

霍亂弧菌上下游引物均為0.2μL，10μmol/L，

創傷弧菌上下游引物0.3μL，10μmol/L，

其中，模板0.2μL，所述模板的濃度為500ng/μL，最后滅菌雙蒸水補足至50μL。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述PCR方法的擴增程序為：94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，進行35個循環，最后72℃延伸5min。