[發(fā)明專利]一種細胞膜長時間多色熒光成像試劑及其制備方法和用途

有效

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• 申請日: 2019-11-06
• 公開（公告）號: CN110836879B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 吳富根;許可飛;賈浩然
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C09K11/06;C08G81/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 楊曉莉

本發(fā)明提供了一種細胞膜長時間多色熒光成像試劑及其制備方法和用途。該細胞膜成像試劑通過兩步法制備：(1)在聚酰胺?胺型樹枝狀高分子(PAMAM)的表面接枝一定數(shù)量的聚乙二醇?膽固醇分子；(2)在第一步得到產(chǎn)物上再接枝不同的熒光分子即得最終的膜成像試劑。該成像試劑制備簡單、水分散性和生物相容性良好、成像快速、適用性廣泛且成像效果維持時間長。該成像試劑中的熒光分子種類多樣，從而能實現(xiàn)不同顏色的細胞膜成像。另外，除了對各種體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞具有優(yōu)異膜成像能力外，該試劑還能對細菌和真菌的細胞膜/壁，以及活體斑馬魚胚胎的表皮細胞的細胞膜進行原位長時間成像。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，特別是涉及一種細胞膜長時間多色熒光成像試劑及其制備方法和用法。

背景技術

細胞膜有重要的生理功能，它既使細胞維持穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，又能調節(jié)和選擇物質進出細胞，保證了細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，使各種生化反應能夠有序運行。細胞膜在功能上與細胞貼壁、遷移、增殖、胞吞、凋亡和信號轉導等重要生命活動密切相關。細胞膜狀態(tài)的變化可以在一定程度上反映細胞內(nèi)各種生化反應的進程以及細胞活性的變化，因而對細胞膜結構與功能的研究可以獲得關于細胞行為和狀態(tài)的重要信息。細胞膜熒光成像技術是細胞膜研究中最簡單和最重要的手段，它不僅可用于直觀地觀察細胞膜的結構，還可動態(tài)追蹤其變化從而觀察到包括胞吐、胞飲、細胞分裂與凋亡在內(nèi)的許多重要的生物活動。

目前常用的細胞膜熒光染料(如DiD家族、FM家族和CellMask等)成像效果并不理想，面臨著容易被細胞內(nèi)吞、熒光穩(wěn)定性不足以及與免疫熒光染色不兼容等諸多問題。其次，目前大多數(shù)商品化的細胞膜染料的成像效果不能長時間維持，極易被細胞內(nèi)吞攝取或從細胞脫落從而無法滿足長時間細胞膜染色觀察的需要。

另外，目前商品化的膜染料很難實現(xiàn)對細菌和真菌細胞的膜/壁成像。最后，現(xiàn)有的細胞膜染料大多只能實現(xiàn)體外培養(yǎng)細胞的成像，而無法實現(xiàn)體內(nèi)細胞(如斑馬魚胚胎表皮細胞)的細胞膜成像。綜上所述，開發(fā)一種長時間成像、成像效果穩(wěn)定、色彩多樣性且能夠實現(xiàn)體內(nèi)層面細胞膜成像的細胞膜熒光探針具有迫切的市場需求。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種細胞膜長時間多色熒光成像試劑及其制備方法和用途。該成像探針具有良好的水分散性和生物相容性，能夠快速且長時間錨定到細胞膜上實現(xiàn)快速及穩(wěn)定的細胞膜成像。此外該探針還能實現(xiàn)斑馬魚胚胎表皮細胞細胞膜的長時間多色成像。

技術方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了一種細胞膜長時間多色熒光成像試劑，該成像試劑是通過在聚酰胺-胺型樹枝狀高分子PAMAM的表面共價修飾聚乙二醇-膽固醇分子和熒光染料分子獲得。

其中，所述聚酰胺-胺型樹枝狀高分子PAMAM的世代數(shù)為第三代、第四代和第五代。所述聚乙二醇-膽固醇分子中聚乙二醇的分子量為500-10000。

優(yōu)選的，所述聚乙二醇-膽固醇分子的修飾密度為PAMAM末端氨基數(shù)量的10％-80％。

所述的熒光染料分子為四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)或吲哚菁類染料。其中，所述吲哚菁類染料選自sulfo-Cy2、sulfo-Cy3、sulfo-Cy5、sulfo-Cy5.5、sulfo-Cy7、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7。

本發(fā)明還公開了上述細胞膜長時間多色熒光成像試劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)稱取N-羥基琥珀酰亞胺酯-聚乙二醇-膽固醇和聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)，分別溶解于二甲基亞砜，溶解后混合，室溫下反應，反應結束后純化，冷凍干燥后即可制得成像試劑前體；