[發明專利]一種功能化磷酸鈣基因遞送系統的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201911070574.5
• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110974979B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 張邦樂;許經良;何煒;馬茜茜;王偉;周四元;宦夢蕾;李晨
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;B82Y5/00;B82Y40/00
• 代理公司: 西安文盛專利代理有限公司 61100
• 代理人: 佘文英

本發明公開了一種功能化磷酸鈣基因遞送系統的制備方法及其應用。本發明以具有氧化還原響應特性的二硫鍵連接阿侖膦酸和甘露醇片段得到含有二硫鍵的甘露醇化阿侖膦酸衍生物。所得含有二硫鍵的甘露醇化阿侖膦酸衍生物進一步修飾于磷酸鈣納米粒表面并負載基因從而形成穩定的功能化磷酸鈣基因遞送系統。本發明所構建的功能化磷酸鈣基因遞送系統具有制備工藝簡單、穩定性和安全性好、轉染效率高等優點，與傳統的磷酸鈣納米粒相比，極大提高穩定性同時，二硫鍵的氧化還原響應性特性可使負載基因快速釋放，顯示出高效的基因轉染活性，具有良好的臨床應用前景。

技術領域

本發明涉及藥物制劑領域和生物醫藥技術領域，具體涉及一種功能化磷酸鈣基因遞送系統的制備方法和應用。

背景技術

基因治療是將治療基因遞送到細胞中，通過影響或替代功能異常的基因，實現基因編輯并糾正遺傳突變從而治療疾病的一種生物醫學治療方法?；蛑委煹年P鍵是構建合適的載體系統以實現治療基因的安全、穩定和高效遞送。在此過程中，基因遞送系統至關重要。

目前，常用的基因載體系統主要有病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體最大的優勢是具有較高的轉染效率。最常用的兩類病毒載體是腺病毒相關病毒載體和逆轉錄病毒載體[Joural of Control Release, 2012, 161(2): 377-388；Biochemistry (Mosc),2016, 81(7): 700-708]。在實際應用過程中，病毒載體的免疫原性和誘發腫瘤的風險可能導致嚴重的臨床不良事件，使其應用受到極大限制[Current Gene Therapy, 2011, 11(4): 321-330；Biotechnology and Bioengineering, 2018, 115(1): 25-40]。此外，病毒載體基因負載量低且難于大規模生產也是其臨床應用受限的原因之一。非病毒載體主要包括磷酸鈣、陽離子脂質體和陽離子聚合物如聚酰胺樹狀高分子、聚乙烯亞胺（PEI）等。非病毒載體毒性較低、生物相容性較好，被視作基因治療中最有前景的遞送系統[NatureReviews Genetics, 2014, 15(8): 541-555; Advances in Genetics, 2014, 88: 231-261; Joural of Control Release, 2016, 240: 165-190；Current Gene Therapy,2017, 17(2): 147-153]，但非病毒載體相對較低的轉染效率限制了其在生物醫學領域的實際應用。

磷酸鈣納米遞送系統是一種常用的非病毒轉染材料，具有優良的生物相容性、簡單的制備方式以及低廉的成本等優點，已成為體外基因轉染的常用材料[CurrentPharmaceutical Design, 2016, 22(11): 1529-1533]。但其穩定性差，制備后極易聚集沉淀，而且轉染效率有待進一步提高。因此，許多的研究者專注于構建磷酸鈣相關的系統來實現有效的基因遞送。Huang等[ACS Nano, 2013, 7: 5376-5384]采用反向微乳法制備了脂質磷酸鈣納米粒，一定程度上提高了其穩定性，并進行了體內轉染實驗，但反相微乳法或其他文獻方法相對復雜且制備過程中運用了含有潛在毒性的有機溶劑和表面活性劑，不利于擴大生產和臨床應用。

二硫鍵在高濃度的谷胱甘肽（GSH）條件下容易發生斷裂。細胞內外的GSH濃度相差十分懸殊，細胞質中的GSH濃度高達1~10 mmol/L，而細胞外的GSH濃度只有1~10 μmol/L[Advances in Clinical Chemistry, 2018, 87: 141-159]。二硫鍵在細胞外環境里可保持穩定，在細胞內則容易發生斷裂，利用二硫鍵的氧化還原響應特性在提高負載基因的血液循環和細胞外抗核酶降解穩定性同時，可實現胞內快速有效釋放，達到高效的基因轉染效果。甘露醇為多羥基類化合物，具有強的親水性，與聚乙二醇一樣具有穩定納米粒的作用。因此，本發明首次將具有氧化還原響應特性的含有二硫鍵的甘露醇化阿侖膦酸衍生物修飾于磷酸鈣納米粒表面并負載基因，在不使用有機溶劑和表面活性劑的情況下，通過簡單的混合即可制備得到穩定性好的功能化磷酸鈣基因遞送系統，實現負載基因的快速有效釋放，從而提高基因遞送與轉染的效率。