[發(fā)明專利]一種功能化磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911070574.5
• 申請(qǐng)日: 2019-11-05
• 公開（公告）號(hào): CN110974979B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張邦樂;許經(jīng)良;何煒;馬茜茜;王偉;周四元;宦夢(mèng)蕾;李晨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;B82Y5/00;B82Y40/00
• 代理公司: 西安文盛專利代理有限公司 61100
• 代理人: 佘文英

1.一種功能化磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備方法，其特征在于以具有氧化還原響應(yīng)特性的二硫鍵連接阿侖膦酸和甘露醇片段得到含有二硫鍵的甘露醇化阿侖膦酸衍生物，所得含有二硫鍵的甘露醇化阿侖膦酸衍生物進(jìn)一步修飾于磷酸鈣納米粒表面并負(fù)載基因從而形成穩(wěn)定的功能化磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)；制備方法具體包括以下步驟：

（1）制備含有二硫鍵的甘露醇化阿侖膦酸衍生物Man-SS-Aln

① 室溫下將1.26 mmol，對(duì)應(yīng)質(zhì)量為341.6 mg的阿侖膦酸鈉溶于10 mL蒸餾水中，使用1 M NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為8；將1.60 mmol，對(duì)應(yīng)質(zhì)量為500 mg 的SPDP溶于10 mL乙腈中，分4次加至反應(yīng)液中，每次加入前用1 M NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為8，用時(shí)2 h；SPDP溶液滴加結(jié)束后，在特定溫度下攪拌反應(yīng)一定時(shí)間；減壓蒸除反應(yīng)液中的乙腈，加入4倍體積的甲醇，室溫下靜置過夜后抽濾，真空干燥后得到白色固體SPDP-Aln；

② 室溫下將205.58 μmol，對(duì)應(yīng)質(zhì)量為100.8 mg的SPDP-Aln溶于5 mL蒸餾水中，加入203.64 μmol，對(duì)應(yīng)質(zhì)量為58.10 mg的Man-Cys，攪拌反應(yīng)3小時(shí)，所述Man-Cys加入方式為：分3次，每次間隔10 min；反應(yīng)液用300 mL Ⅲ級(jí)水快速透析1 h后，冷凍干燥得到白色固體Man-SS-Aln；

（2）基因遞送系統(tǒng)制備溶液的配制：溶液a由鈣鹽和水配制，鈣鹽濃度為2.5 M；溶液b由磷酸鹽、氯化鈉、緩沖劑和水配制，磷酸鹽濃度為1.5 mM，氯化鈉濃度為0.28 mM，緩沖劑濃度為0.05 mM、pH為7.05；溶液c由甘露醇化阿侖膦酸衍生物Man-SS-Aln和水配制，Man-SS-Aln濃度為4.3 μM，

其中Man-Cys的結(jié)構(gòu)式如式（1）、SPDP-Aln的結(jié)構(gòu)式如式（2）、Man-SS-Aln的結(jié)構(gòu)式如式（3）：

（3）將目的基因與溶液a混合，用雙蒸水將其稀釋為溶液a體積的十倍后，與溶液b等體積混合均勻，再加入與溶液b等體積的溶液c，制備得到負(fù)載基因的功能化磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：在步驟（2）中，所述溶液a中鈣鹽為CaCl₂、Ca(NO₃)₂中的一種或兩種任意比例的組合；所述溶液b中磷酸鹽為Na₃PO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、K₃PO₄、K₂HPO₄、KH₂PO₄、(NH₄)₃PO₄、(NH₄)₂HPO₄的一種或兩種以上的任意比例組合；緩沖劑為HEPES、BES、PBS、PIPES、Tris中的一種或兩種以上的任意比例組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能化磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：在步驟（3）中，所述基因?yàn)镈NA、siRNA、miRNA、lncRNA、circRNA或shRNA中的任一或多種；基因與溶液a混合時(shí)的基因質(zhì)量與溶液a體積的比例為50~5000 μg/mL。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1制備的功能化磷酸鈣基因遞送系統(tǒng)在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。