[發明專利]一種特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導向序列及其應用

有效

• 申請號: 201911070458.3
• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110878301B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 付燦;于鴻浩;岳鵬鵬;李勇;農月娟
• 申請（專利權）人: 桂林醫學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 蔣杰

本發明公開了一種特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導向序列及其應用，屬于醫學遺傳學和分子生物學技術領域。所述sgRNA對應的核苷酸序列含有SEQ ID NO.2所示序列，本發明還公開了利用上述的特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導向序列編輯小鼠G6pc基因的方法。本發明的sgRNA導向序列可以介導Cas9蛋白，高效地切割靶點DNA，進而用于編輯小鼠G6pc基因，影響小鼠G6pc基因編碼蛋白的功能。該sgRNA導向序列可以通過CRISPR/Cas9系統實現高效打靶，效率為100％。

技術領域

本發明涉及一種特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導向序列及其應用，屬于醫學遺傳學和分子生物學技術領域。

背景技術

成簇規律間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,associated RNA guided endonuclease Cas,CRISPR/Cas)是細菌和古細菌在長期進化過程中形成的抵御外來遺傳物質的獲得性免疫防御系統。其中，II型CRISPR/Cas9系統結構較為簡單，通過基因工程改造，被廣泛用于各個物種的基因編輯。該系統包含Cas9蛋白和sgRNA兩個元件，sgRNA通過堿基互補配對的方式靶向結合在基因組DNA長度約為20nt的互補序列上，介導Cas9蛋白的HNH活性位點和RuvC活性位點切割DNA雙鏈，導致DNA雙鏈斷裂。細胞通過非同源末端連接或同源重組的方式修復DNA雙鏈斷裂損傷，修復時核苷酸會在斷裂處隨機的插入或缺失或同源重組插入，導致修復后的序列與原序列并不完全一致，進而達到基因編輯的目的。與ZFN和TALENs相比，CRISPR-Cas9具有更快速、簡便、高效、多位點、特異性靶向敲除基因的優勢。

sgRNA，即single guide RNA的簡稱，中文名稱為向導RNA。Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA)和靶序列互補識別的原理實現的。現在已經把兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(single guideRNA)。因此，sgRNA能否做到高效靶向目標基因是CRISPR-Cas9能否特異性編輯目標基因的先決條件，尤其是基因敲除和基因敲入，sgRNA的高效性對其影響至關重要。因此，能夠設計、制備出高效靶向目標基因的sgRNA是基于CRISPR-Cas9系統進行基因編輯的關鍵。

人G6PC基因編碼葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)。G6Pase是一種水解磷酸化合物的磷酸酶，主要在肝組織中表達，可以將葡糖-6-磷酸水解為葡萄糖，促使葡萄糖進入血液，從而調控血糖濃度，維持血糖平衡，是糖代謝的關鍵酶。G6PC基因突變后可導致蛋白功能失常，引起Ⅰ型糖原貯積病。本病為常染色體隱性遺傳，兩性均可罹病。臨床癥狀表現為葡萄糖穩態受損、空腹低血糖、生長遲緩、肝腫大、腎病、高脂血癥、高尿酸血癥和乳酸血癥等，目前尚無良好治療方法。

G6pc基因突變是人類I型糖原貯積癥的主要病因，其突變具有多種類型，包括點突變、同義突變、無義突變和錯義突變，不同的突變引起的臨床癥狀不同，有些不患病，有些患病，患病程度亦不相同。因此，有必要篩查明確的、典型的G6PC致病突變位點，并將突變位點定位于小鼠基因組上，然后通過CRISPR/Cas9系統對該位點進行打靶，可以建立G6pc基因突變細胞模型或動物模型，從而精準的模擬I型糖原貯積病，為深入的理解G6PC基因的致病機制以及探索可行的治療策略具有重要意義。然而，目前并沒有針對小鼠G6pc基因的sgRNA導向序列以及敲除該基因的方法。鑒于此，有必要提供一種可以模擬人類致病突變的特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導向序列及利用其特異性敲除G6pc基因的方法，以解決現有技術的不足。

發明內容