[發(fā)明專利]一種特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導(dǎo)向序列及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911070458.3
• 申請(qǐng)日: 2019-11-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110878301B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付燦;于鴻浩;岳鵬鵬;李勇;農(nóng)月娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 桂林醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N9/22;A01K67/027
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 蔣杰

1.一種特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導(dǎo)向核苷酸片段，其特征在于，所述sgRNA對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示序列。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導(dǎo)向序列編輯小鼠G6pc基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：在權(quán)利要求1所述的特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導(dǎo)向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列；

同時(shí)根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異靶向小鼠G6pc基因的sgRNA導(dǎo)向序列獲得其對(duì)應(yīng)的DNA互補(bǔ)鏈，并且在DNA互補(bǔ)鏈的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列；

將正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列退火，形成具有粘性末端的雙鏈DNA片段；

步驟2：利用Bsa I限制性內(nèi)切酶酶切SEQ ID NO.5所示的目標(biāo)載體pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒，得到酶切產(chǎn)物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I；

步驟3：將步驟1得到的具有粘性末端的雙鏈DNA片段和步驟2得到的酶切產(chǎn)物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌并涂布于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)20h后，挑取單克隆并用SEQ ID NO.6所示的通用引物U6通過(guò)測(cè)序鑒定出陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆搖菌、提取質(zhì)粒，得到pGL3-U6-G6pc-sgRNA質(zhì)粒；

步驟4：將步驟3得到的pGL3-U6-G6pc-sgRNA質(zhì)粒和SEQ ID NO.7所示的pST1374-NLS-flag-l inker-Cas9表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染小鼠N2a細(xì)胞，經(jīng)藥物篩選后得到陽(yáng)性的sgRNA-Cas9共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

步驟5：將步驟4得到的陽(yáng)性的sgRNA-Cas9共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，以得到的細(xì)胞裂解液為模板進(jìn)行打靶位點(diǎn)DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，取打靶位點(diǎn)DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，如果打靶位點(diǎn)出現(xiàn)套峰，則初步確認(rèn)發(fā)生了基因編輯；

步驟6：TA克隆測(cè)序分析步驟5初步確認(rèn)發(fā)生了基因編輯的打靶位點(diǎn)的基因型，并獲得基因編輯后的小鼠細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編輯小鼠G6pc基因的方法，其特征在于，步驟1中，所述退火的反應(yīng)體系具體為：10μM正向寡核苷酸，5μL；10μM反向寡核苷酸，5μL；10×T7 EndonucleaseI buffer，2μL；ddH₂O，8μL；反應(yīng)程序具體為：95℃，5min；95℃到85℃，-1℃/循環(huán)，共10個(gè)循環(huán)；85℃到25℃，-0.1℃/循環(huán)，共600個(gè)循環(huán)，退火產(chǎn)物-20℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編輯小鼠G6pc基因的方法，其特征在于，步驟2中，所述酶切的反應(yīng)體系具體為：pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒，2μg；10×酶切buffer，2μL；Bsa I限制性內(nèi)切酶，2μL；補(bǔ)充ddH₂O至總體積20μL，將酶切反應(yīng)體系置于37℃反應(yīng)3h。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編輯小鼠G6pc基因的方法，其特征在于，步驟3中，所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的具體方法為：取5μL連接產(chǎn)物快速加入到30μL感受態(tài)大腸桿菌中，充分混勻，冰上靜置25min，42℃水浴熱激90s，冰上冷卻2min，加入150μL的LB液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/min，37℃活化30min，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基表面；所述含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的濃度為50μg/mL；所述搖菌的溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/min，過(guò)夜培養(yǎng)；所述提取質(zhì)粒采用去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編輯小鼠G6pc基因的方法，其特征在于，步驟4中，所述藥物為濃度為50μg/ml的嘌呤霉素和濃度為100μg/ml的殺稻瘟菌素；所述小鼠N2a細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前，先接種培養(yǎng)于含10％v/v胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d-3d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80％-90％后，以0.25％胰蛋白酶消化，然后傳代于6孔板中，18h-20h后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60％-70％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。