[發明專利]一種特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列及其應用

有效

• 申請號: 201911070099.1
• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110862982B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 于鴻浩;付燦;岳鵬鵬;李勇;高進濤
• 申請（專利權）人: 桂林醫學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12Q1/02
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 蔣杰

本發明公開了一種特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列及其應用，屬于醫學遺傳學和分子生物學技術領域。所述sgRNA對應的核苷酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意一種序列。本發明還公開了利用上述的特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列編輯小鼠Gaa基因的方法。本發明的sgRNA導向序列可以介導Cas9蛋白高效地切割靶點DNA，進而用于編輯小鼠Gaa基因，影響小鼠Gaa基因編碼蛋白的功能。本發明的sgRNA導向序列可以通過CRISPR/Cas9系統實現高效打靶，效率均為100％。

技術領域

本發明涉及一種特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列及其應用，屬于醫學遺傳學和分子生物學技術領域。

背景技術

CRISPR/Cas系統最早在細菌中被發現，其在真細菌和古細菌中行使獲得性免疫功能，可抵抗外源病毒和質粒入侵。人們通過基因工程手段對微生物自身生物的CRISPR/Cas系統進行改造，從而創造了可廣泛應用于高等生物的基因編輯的打靶系統，CRISPR/Cas9系統。該系統自2012年問世以來，其為生命科學以及生物醫學研究注入了強大的動力，成為近年來的研究熱點。2013年起，研究者們利用CRISPR/Cas9的DNA結合活性與內切酶活性，成功地在哺乳動物細胞中對基因組進行了編輯。在CRISPR/Cas9系統中，Cas9內切酶在單鏈向導RNA(single guide RNA,sgRNA)的指引下，通過堿基互補配對原則，結合到基因組靶點位置，產生雙鏈DNA斷裂(DSBs)，從而引發細胞內的修復機制，即非同源末端連接途徑(NHEJ)或同源重組定向修復(HDR)，在修復過程中發生堿基的缺失或插入，最終達到基因編輯的目的。Cas9蛋白結合靶點的關鍵是sgRNA(與靶點互補的序列約20bp)，僅改變sgRNA序列，即可對感興趣的幾乎任意基因組區域進行編輯。與應用較早的基因編輯技術如鋅指蛋白核酸酶(ZFN)或轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系統具有設計靈活、成本低、操作簡單、準確性高、可多位點同時打靶等優勢。

sgRNA中文名稱為向導RNA。原核生物中Cas9靶向切割DNA是需要兩種小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA)和靶序列互補識別的原理實現的。目前，通過基因工程手段將這兩種小RNA融合為一種RNA，即sgRNA。sgRNA的主要功能是識別和結合到目標基因組DNA上，并介導Cas9蛋白切割DNA雙鏈。因此，sgRNA能否做到高效靶向識別和結合目標基因是CRISPR-Cas9能否特異性編輯目標基因的先決條件，尤其是基因敲除和基因敲入，sgRNA的高效性對基因打靶的影響至關重要。因此，能夠設計、制備出高效靶向目標基因的sgRNA是基于CRISPR-Cas9系統進行基因編輯的關鍵。

龐貝氏癥(Pompe disease)，又稱酸性麥芽糖酵素缺乏癥或II型肝糖貯積癥或II型糖原累積癥，是一種常染色體隱性遺傳病。其病因是人體內缺乏酸性α-葡萄糖苷酶，導致肝糖原無法分解。根據發病時間，可分為嬰兒型和晚發型兩種。嬰兒型患者即出生后月6個月左右個體患此病，臨床表現未重癥肌無力，舌頭心臟和肝臟肥大，呼吸困難以及發育遲緩，通?；畈贿^2歲。晚發型，患者約在20-60歲期間發病，臨床表現為漸行性肌無力，呼吸短促，頭疼等癥狀。目前，由于對該病的分子機理仍不清楚，尚無良好治療方法。