[發明專利]一種特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列及其應用

有效

• 申請號: 201911070099.1
• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110862982B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 于鴻浩;付燦;岳鵬鵬;李勇;高進濤
• 申請（專利權）人: 桂林醫學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12Q1/02
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 蔣杰

1.一種特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向核苷酸片段，其特征在于，所述sgRNA對應的核苷酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意一種序列。

2.一種利用權利要求1所述的特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列編輯小鼠Gaa基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：在權利要求1所述的特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列；

同時根據權利要求1所述的特異靶向小鼠Gaa基因的sgRNA導向序列獲得其對應的DNA互補鏈，并且在DNA互補鏈的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列；

將正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列退火，形成具有粘性末端的雙鏈DNA片段；

步驟2：利用Bsa I限制性內切酶酶切SEQ ID NO.5所示的目標載體pGL3-U6-sgRNA質粒，得到酶切產物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I；

步驟3：將步驟1得到的具有粘性末端的雙鏈DNA片段和步驟2得到的酶切產物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I連接，將連接產物轉化感受態大腸桿菌并涂布于氨芐抗性的LB培養基上，37℃過夜培養20h后，挑取單克隆并用SEQ ID NO.6所示的通用引物U6通過測序鑒定出陽性克隆，對陽性克隆搖菌、提取質粒，得到pGL3-U6-Gaa-sgRNA質粒；

步驟4：將步驟3得到的pGL3-U6-Gaa-sgRNA質粒和SEQ ID NO.7所示的pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表達質粒，共轉染小鼠3T3細胞，經藥物篩選后，得到陽性的sgRNA-Cas9共轉染細胞；

步驟5：將步驟4得到的陽性的sgRNA-Cas9共轉染細胞進行細胞裂解，以得到的細胞裂解液為模板進行打靶位點DNA的PCR擴增反應，取打靶位點DNA的PCR擴增產物進行Sanger測序，如果打靶位點出現套峰，則初步確認發生了基因編輯；

步驟6：TA克隆測序分析步驟5初步確認發生了基因編輯的打靶位點的基因型，并獲得基因編輯后的小鼠細胞。

3.根據權利要求2所述的編輯小鼠Gaa基因的方法，其特征在于，步驟1中，所述退火的反應體系具體為：10μM正向寡核苷酸，5μL；10μM反向寡核苷酸，5μL；10×T7 EndonucleaseI buffer，2μL；ddH₂O，8μL；反應程序具體為：95℃，5min；95℃到85℃，-1℃/循環，共10個循環；85℃到25℃，-0.1℃/循環，共600個循環，退火產物-20℃保存。

4.根據權利要求2所述的編輯小鼠Gaa基因的方法，其特征在于，步驟2中，所述酶切的反應體系具體為：pGL3-U6-sgRNA質粒，2μg；10×酶切buffer，2μL；Bsa I限制性內切酶，2μL；補充ddH₂O至總體積20μL，將酶切反應體系置于37℃反應3h。

5.根據權利要求2所述的編輯小鼠Gaa基因的方法，其特征在于，步驟3中，所述轉化感受態大腸桿菌的具體方法為：取5μL連接產物快速加入到30μL感受態大腸桿菌中，充分混勻，冰上靜置25min，42℃水浴熱激90s，冰上冷卻2min，加入150μL的LB液體培養基，轉速為220轉/min，37℃活化30min，然后涂布于氨芐抗性的LB培養基表面；所述具有氨芐抗性的LB培養基中，氨芐青霉素的濃度為50μg/mL；所述搖菌的溫度為37℃，轉速為220轉/min，涂布于培養基上后，倒置過夜培養；所述提取質粒采用去內毒素質粒中提試劑盒。

6.根據權利要求2所述的編輯小鼠Gaa基因的方法，其特征在于，步驟4中，所述藥物為濃度為10μg/ml的嘌呤霉素和濃度為20μg/ml的殺稻瘟菌素；所述小鼠3T3細胞在轉染前，先接種培養于含5％v/v胎牛血清的DMEM完全培養基中，于37℃，5％CO₂培養箱中培養，每2d-3d更換新鮮培養基，待細胞匯合度達到80％-90％后，以0.25％胰蛋白酶消化，然后傳代于6孔板中，16h-18h后，待細胞匯合度達到80％-90％時進行轉染。