[發明專利]一種檢測骨結核標本中環絲氨酸濃度的方法

有效

• 申請號: 201911069160.0
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110824039B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 黃海榮;于霞;文舒安;張婷婷;姜廣路
• 申請（專利權）人: 北京市結核病胸部腫瘤研究所;首都醫科大學附屬北京胸科醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N1/28;G01N1/42
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種檢測骨結核標本中環絲氨酸濃度的方法，包括如下步驟：(1)將骨結核標本先用液氮冷凍，等液氮揮發后，加溶劑研磨并進行環絲氨酸提取，收集組織提取液；

所述溶劑為水；

所述提取在勻漿條件下進行；

(2)對所述組織提取液和環絲氨酸標準溶液采用高效液相色譜-質譜聯用進行檢測；測定時，如所述組織提取液色譜峰的保留時間與所述環絲氨酸標準溶液一致，并在扣除背景后的樣品質譜中，所選擇的定性離子均出現，且豐度與所述環絲氨酸標準溶液的離子豐度比相一致，判定環絲氨酸檢出；

(3)根據步驟(2)得到的所述高效液相色譜-質譜聯用測定的所述組織提取液的數據，采用內標法對所述骨結核標本中的環絲氨酸的含量進行定量分析，即得到骨結核標本中環絲氨酸濃度；

所述內標法采用的內標物為對乙酰氨基酚；

所述高效液相色譜-質譜聯用的檢測條件如下：a)進樣體積：2μL；

b)色譜柱：液相色譜柱ZORBAX SB-Aq，2.1×50mm，3.5Micron；

c)流動相：A相為5mM甲酸銨 水溶液，B相為含體積百分比0.1％甲酸的甲醇溶液；

d)梯度程序：流動相A:85％/B:15％等度洗脫，停止時間4min；

e)流速：0.3mL/min；

f)離子源：電噴霧離子源-正離子模式；

g)檢測方式：多反應監測；

h)離子源溫度：300℃；

i)毛細管電壓：4kV；

j)碰撞氣、氣簾氣、霧化氣、輔助氣均為高純氮氣，使用前調節各氣流流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；

k)去簇電壓、碰撞能量應優化至最佳靈敏度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：采用陶瓷珠進行所述研磨。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟(1)中還包括對所述骨結核標本進行如下處理的步驟：用生理鹽水沖去附著血液，用濾紙擦干殘液和附著組織，勻漿前先將骨結核標本用液氮冷凍，等液氮揮發后，加入溶劑研磨；

所述研磨的條件：速率為6m/s，100s間歇1min，重復一次；

所述提取的過程如下：4℃放置5h，其間每1小時間斷渦旋：6m/s速度渦旋20s；然后4℃離心10min，收集上清。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述環絲氨酸的檢測離子對如下：m/z103.0/75.0作為定量離子對、m/z 103.0/58.0作為定性離子對；碎裂電壓為45V；碰撞能量為2eV。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：定量分析步驟(3)中包括如下步驟：1)對于步驟(2)中配制至少6個不同濃度的所述環絲氨酸標準溶液加入相同濃度的內標物工作液，將所述標準溶液采用所述的高效 液相色譜-質譜聯用進行檢測，得到不同濃度的環絲氨酸的色譜峰面積和內標物的色譜峰面積，以所述標準溶液與所述內標物的濃度比為橫坐標，以所述標準溶液與所述內標物的峰面積比為縱坐標，制作標準工作曲線并得到回歸方程；

2)在步驟(2)所述組織提取液中加入步驟1)中相同濃度的所述的內標物工作液，采用所述的高液相色譜-質譜聯用進行檢測，得到所述組織提取液中環絲氨酸的峰面積帶入所述回歸方程中，計算即得到所述骨結核標本中的環絲氨酸的含量。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述環絲氨酸標準溶液的濃度為0.2～30μg/mL；

所述內標物的儲存液濃度為1mg/ml，稀釋至20μg/mL。