[發(fā)明專利]一種快速提取純化藍藻總RNA的方法

在審

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• 申請日: 2019-11-05
• 公開（公告）號: CN110804610A
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于鑫;李曦;李晶晶;陳輝;葉成松
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所;廈門大學(xué);福建省水利水電勘測設(shè)計研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種快速提取純化藍藻總RNA的方法，其特征是在柱式細菌提取RNA的方法基礎(chǔ)上，發(fā)明了兩步前處理和一步預(yù)純化的方法，從而實現(xiàn)了快速提取和純化藍藻總RNA。本發(fā)明適用于提取藍藻總RNA，本發(fā)明所述的方法操作簡單，省時，僅需30min即可完成藍藻RNA的提取和純化，提取的RNA純度高（無DNA污染），完整性好，可用于后續(xù)的分子生物學(xué)實驗。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速提取純化藍藻RNA的方法。

背景技術(shù)

藍藻，又稱藍細菌，屬于原核生物，是地球上最古老的生物之一，在藻類中，藍藻也是最簡單、最原始的單細胞生物。近年來，隨著水體富營養(yǎng)化的加劇，藍藻水華日益嚴重，給人類生活生產(chǎn)以及水生生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴重威脅。

RNA是藍藻細胞內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，是研究其生理生化功能的關(guān)鍵，分離獲得高純度、完整的RNA是進行RT-PCR，qRT-PCR、Northern雜交等分子生物學(xué)實驗的關(guān)鍵。

目前，柱式細菌提取RNA的方法得到廣泛應(yīng)用，其中普遍采用溶菌酶的方法破壁，但是大多數(shù)藍藻的細胞壁外面有膠質(zhì)衣，并含有大量胞外多糖，其特殊的細胞壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其細胞破碎不完全，另外在實際水體中，藍藻細胞會形成團聚體（例如：微囊藻），細胞間由大量粘液和膠質(zhì)鞘對細胞進行保護，導(dǎo)致普通破壁方法對團聚體細胞難以破碎，因此RNA的提取效率非常低。同時，由于DNA和RNA相似的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致該方法提取的RNA樣品往往伴隨著DNA的污染。

將藻細胞在液氮中研磨至粉末狀的方法能有效促進藻細胞的破裂，但是其后續(xù)的提取步驟繁瑣耗時，而樣品中外源和內(nèi)源的RNase會導(dǎo)致RNA的降解，從而影響RNA的提取質(zhì)量。

因此，有必要開發(fā)出一種既能解決藍藻細胞破壁問題，又能避免RNA被RNase降解，同時還能快速、高效獲得高純度藍藻總RNA提取方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有藍藻總RNA提取方法提取效率低及RNA純度不好的缺點，提供了一種可以獲得高純度藍藻總RNA的快速提取方法。

本發(fā)明在柱式細菌提取RNA的方法基礎(chǔ)上，發(fā)明了兩步前處理和一步預(yù)純化的方法，從而實現(xiàn)了快速提取和純化藍藻總RNA。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

第一步：準備藻液：藻細胞濃度 （相當(dāng)于葉綠素a=10-50 μg/L），合適的藻細胞濃度有利于RNA的抽提純化，也是該技術(shù)方法成敗的關(guān)鍵；（低濃度的藻細胞密度會導(dǎo)致RNA提取濃度低，質(zhì)量差；高濃度的藻細胞密度會導(dǎo)致RNA提取效率和RNA純度低）

第二步：收集藻細胞：取5-15 mL的藻液至50 mL離心管，離心6000-8000 g，時間1-3min，去上清液；

第三步：清洗藻細胞：加入0.9 % Nacl 5-10 mL，渦輪混勻10-30 s，懸浮藻細胞，再次離心6000-8000 g，時間1 -3min，去上清液；

第四步：前處理1：藻細胞樣品迅速轉(zhuǎn)移至液氮凍存1-3 min，取出藻細胞塊，液氮研磨3-5min，研磨至粉末狀；

第五步：前處理2：將全部藻粉轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管 （DEPC水處理，RNase-free），加入50-150μL 溶菌酶溶液（濃度：3-5 mg/L），渦輪混勻20-40 s；

第六步：預(yù)純化：向藍藻懸浮液中加入DNase（8-10 μL, 濃度 0.5-2 U/ul）和RNase 抑制劑（3-5 μL ，濃度20-60 U/ul）

第七步：RNA抽提：利用柱式細菌總RNA抽提試劑盒對藻溶液樣品進行RNA提取。