[發明專利]一種永生化人肝星狀細胞株及其制備方法

在審

• 申請號: 201911067543.4
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110699326A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 郭津生;斯科特·福瑞德曼
• 申請（專利權）人: 郭津生
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/071;C12N15/867
• 代理公司: 41182 焦作加貝專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 馮新志

本發明公開了一種永生化人肝星狀細胞株及其制備方法，屬于細胞生物學領域。所述永生化人肝星狀細胞WM07于2019年9月19日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保存編號是CGMCC No.18522。本發明通過構建一種能夠高效、快速轉染的SV40 T抗原慢病毒表達載體，該載體通過工程細胞包裝可獲得表達SV40 T抗原的慢病毒顆粒用于轉染原代分離人肝星狀細胞，進而通過博來霉素（zeocin）抗性特點篩選獲得永生化人肝星狀細胞株。本發明的永生化人肝星狀細胞株WM07可穩定傳代，并可用于肝纖維化研究，具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，具體地，涉及一種永生化人肝星狀細胞株及其制備方法。

背景技術

肝星狀細胞(HSC)是肝臟的一種非實質細胞，在肝纖維化發生中起到關鍵作用，原代分離的肝星狀細胞在體外的培養和傳代時間有限，傳代一定次數后就會進入衰老期而不能再繼續增殖。而反復分離原代細胞不僅費時費力，而且各批次細胞間存在差異，不能保持細胞生理指標的穩定性。建立和改良人肝星狀細胞的原代分離培養方法及獲得永生化人肝星狀細胞株對于肝纖維化發生機制、診斷及治療研究具有重要意義。

一些抑癌基因P53和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人體細胞獲得永生化的必要條件。哺乳動物細胞使用幾種方法誘導細胞永生化(Cell immortalizing)，其中包括使用猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)T抗原基因、人類端粒酶逆轉錄酶基因、P53和pRB的shRNAs等。SV40大T抗原是由SV40病毒早期編碼區編碼的一種多功能磷酸蛋白，在病毒復制過程中發揮著重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主細胞核糖體基因、誘導DNA合成、修飾蛋白質合成起始因子等作用，并且能結合、調控某些關鍵性的細胞調控蛋白，如視網膜母細胞瘤蛋白家族成員(如 pRB)、腫瘤抑制因子p53等，并可誘導感染細胞的端粒酶活性，誘導多種細胞的永生化。通過對SV40大T抗原介導的永生化細胞系的深入研究發現：SV40大T 抗原基因與宿主細胞DNA穩定整合重組后，不但能在細胞內表達SV40大T抗原，加快轉化細胞的生長速率，同時也能保留原始細胞的許多分化表型，具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，而在轉化細胞系中非原始基因的表達很少見。

已有通過脂質體介導構建有SV40大T抗原基因的真核表達質粒載體轉染目標原代細胞并篩選獲得永生化人肝星狀細胞(LX2)，但其轉染效率較低，篩選困難，一些較難轉染的細胞難以獲得穩定表達和建立細胞系。

發明內容

為了解決上述技術問題，發明人通過建立改良人肝星狀細胞分離和原代培養的方法，并基于慢病毒載體介導SV40T抗原轉染和篩選，成功獲得一種永生化人肝星狀細胞株WM07，為肝纖維化相關研究提供穩定、充足的細胞材料，從而完成本發明。

因此，本發明的目的是提供一種永生化人肝星狀細胞株及其制備方法，為達到上述目的，

本發明的第一方面提供一種人永生化人肝星狀細胞WM07，該永生化人肝星狀細胞WM07于2019年9月19日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保存編號是CGMCC No.18522。保藏地址中國北京。

本發明的第二方面提供一種人永生化肝星狀細胞株的制備方法，包括步驟如下：

1.構建SV-40T抗原慢病毒表達載體：

(1)以含SV40T抗原cDNA序列的SV40tsA58質粒為模板，根據NCBI的 SV 40完整基因組(NC_001669.1)設計特定的質粒構建引物，高保真PCR獲取 SV40T抗原全長cDNA，對擴增得到PCR產物進行純化。

在本發明的一些實施方案中，所述構建引物包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物。