[發(fā)明專(zhuān)利]一種永生化人肝星狀細(xì)胞株及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911067543.4
• 申請(qǐng)日: 2019-11-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110699326A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭津生;斯科特·福瑞德曼
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 郭津生
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/10;C12N5/071;C12N15/867
• 代理公司: 41182 焦作加貝專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 馮新志

1.一種永生化人肝星狀細(xì)胞WM07，其特征在于，所述永生化人肝星狀細(xì)胞WM07于2019年9月19日保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保存編號(hào)是CGMCC No.18522。

2.一種構(gòu)建永生化人肝星狀細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)構(gòu)建SV40 T抗原慢病毒表達(dá)載體：

以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58質(zhì)粒為模板，根據(jù)NCBI的SV 40完整基因組(NC_001669.1)設(shè)計(jì)特定的質(zhì)粒構(gòu)建引物，高保真PCR獲取SV40 T抗原全長(zhǎng)cDNA，對(duì)擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；

將PCR產(chǎn)物TOPO克隆進(jìn)入pENTR^TM TOPO載體，獲得pENTR-SV40 T質(zhì)粒；

LR重組反應(yīng)將pENTR-SV40 T質(zhì)粒中的SV40 T抗原cDNA克隆到目標(biāo)慢病毒載體，構(gòu)建SV40 T抗原慢病毒表達(dá)載體pLenti4/V5-GW/SV40 T，

2)慢病毒包裝：

采用脂質(zhì)體Lipofectamine^TM2000介導(dǎo)pLenti4/V5-SV40 T和包裝質(zhì)粒pCMV-VSV-G及psPAX2轉(zhuǎn)染工程細(xì)胞293FT，進(jìn)行假病毒包裝，

3)慢病毒介導(dǎo)SV40 T抗原轉(zhuǎn)染原代分離細(xì)胞獲得永生化細(xì)胞株：

分離和原代培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞，用含SV40 T抗原的輪替病毒培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞，以博來(lái)霉素抗性特點(diǎn)篩選轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)SV40 T抗原的原代培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞，獲得永生化人肝星狀細(xì)胞株。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述構(gòu)建引物包括具有SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，利用以M13正向和逆向引物對(duì)pENTR-SV40 T質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序?qū)λ鰌ENTR-SV40 T質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述LR重組反應(yīng)具體包括：1.5mL離心管中加入7μL所述pENTR-SV40 T質(zhì)粒、1μL目標(biāo)慢病毒載體pLenti4/V5-DEST、8μLTE緩沖液、2μL LR Clonase^TMII enzyme mix，混勻，25℃孵育1h，加入1μL蛋白酶K溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)液混勻后37℃孵育10min。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括以下步驟：轉(zhuǎn)化1μL所述反應(yīng)液于50μL Stbl3^TM感受態(tài)細(xì)胞，冰上孵育30min，42℃熱休克30秒，加入250μL S.O.C.培養(yǎng)液，37℃振搖培養(yǎng)1h，分別將20μL和100μL轉(zhuǎn)化液鋪于氨芐青霉素LB瓊脂板。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述分離和原代培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞包括：

(1)獲取新鮮人肝臟標(biāo)本；

(2)采改良酶液灌注消化及Nycodenz密度梯度離心兩步法分離人肝星狀細(xì)胞；

(3)對(duì)分離的人肝星狀細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。

8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括對(duì)獲得的永生化人肝星狀細(xì)胞株進(jìn)行鑒定的步驟。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述鑒定包括生物學(xué)特征鑒定、細(xì)胞株的可傳代性鑒定、細(xì)胞株SV40 T抗原表達(dá)檢測(cè)。

10.一種永生化人肝星狀細(xì)胞，其特征在于，所述永生化人肝星狀細(xì)胞是利用權(quán)利要求2-7任一所述的方法得到的。