[發明專利]一種供臨床使用的脫細胞角膜基質的制備方法

有效

• 申請號: 201911066843.0
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110841111B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 王海利;張晉南;宇詠梅;唐小琪;馬百雙;甘良波
• 申請（專利權）人: 深圳艾尼爾角膜工程有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/50
• 代理公司: 北京康盛知識產權代理有限公司 11331
• 代理人: 董娣

本發明公開了一種供臨床使用的脫細胞角膜基質的制備方法，該方法包括去除角膜上皮層之后削切得到預定厚度的板層角膜，還包括將削切后的板層角膜密封后置于液氮中冷凍、將冷凍后的板層角膜置于水浴中解凍、將解凍后的板層角膜放入脫細胞試劑中進行振蕩處理、將振蕩處理后的板層角膜置于等滲液中進行超聲處理、將脫細胞后的板層角膜放入軟化液中靜置，冷凍、解凍以及在脫細胞試劑中振蕩處理有利于脫除細胞，在軟化液中靜置有利于角膜膠原微觀結構的恢復，再放入水中振蕩處理，得到透明性好,微觀膠原結構接近于人體角膜并且不需經過其他處理而直接能供臨床使用的脫細胞角膜基質。

技術領域

本發明屬于組織工程技術領域，具體涉及一種供人類臨床使用的脫細胞角膜基質的制備方法。

背景技術

引起角膜盲的第二大原因是角膜病，角膜病中80％的患者可通過角膜移植來避免致盲。但是受我國角膜捐獻較少，導致同種異體角膜供體匱乏，人工角膜的出現給角膜病患者帶來了希望。隨著組織工程學的興起，人們將焦點集中在天然的動物角膜材料。利用脫細胞的方法去除異種角膜的外源細胞及抗原物質，從而獲得異種無細胞的角膜細胞外基質材料。組織工程角膜材料在臨床應用須要滿足三個最基本的要求，一是異種角膜細胞被脫除的徹底性，二是角膜的透明度，三是角膜的生理弧度。組織工程角膜材料移植到患者身上時，如果異種細胞脫除不徹底，將產生免疫排斥反應，導致移植效果不佳；如果脫細胞過程中對角膜微觀結構破壞較大，移植后透明度恢復不好，依然影響患者視力，患者的生活并未得到改善；因此，影響角膜術后透明度的主要因素有：異種細胞脫除是否徹底，角膜是否具有其原有的膠原微觀結構，以及角膜是否具有其原有的生理弧度，這些因素將決定角膜材料能否在臨床上成功應用。

目前常用的脫細胞方法包括化學法、物理法和生物酶法。常規單一的化學法或者物理法脫細胞需要長時間的作用才能達到脫細胞效果，且長時間的作用又會造成角膜膠原蛋白的微觀結構破壞。專利文獻201510074946.7(專利名稱：一種人工角膜的制備方法)利用板層刀制備板層角膜，鉆取指定大小的角膜片，通過凍融、超聲聯合核酸內切酶降解法進行脫細胞。該方法中利用板層刀獲取板層角膜，無法保證切面的平整性，從而影響移植后與植床的貼合性，導致術后透明度的恢復。專利文獻201410230365.3(專利名稱：一種板層角膜基質支架及其制備方法)將動物角膜依次進行低滲溶脹、反復凍融、利用DNA酶和RNA酶的緩沖體系進行酶消化處理。專利文獻201610080864.8(專利名稱：利用新鮮牛角膜以制備牛角膜基質的方法及應用方法)將牛角膜浸泡在低滲溶液中，取出角膜上皮細胞得到包含前彈力層和比分基質層的牛角膜基質，反復凍融后再用緩沖液漂洗，放入脫細胞試劑中浸泡脫細胞，再用超純水對牛角膜基質進行沖洗，最后放入脫水劑中浸泡、滅菌，制得牛角膜基質。以上兩件專利技術均使用了低滲溶液，這種溶液致使角膜易溶脹，對角膜基質結構破壞性較大，且未對脫細胞后的角膜進行孵育軟化。

發明內容

針對現有技術的缺點和局限，本發明提供一種采用物理方法和低毒性試劑，制備得到透明性好,微觀膠原結構接近于人體角膜并且能供臨床使用的脫細胞角膜基質的方法。該方法包括：去除角膜上皮層之后削切得到預定厚度的板層角膜，還包括：

a)將削切后的角膜密封后置于液氮中冷凍；

b)將冷凍后的角膜置于水浴中解凍；

c)將解凍后的角膜放入脫細胞試劑中進行振蕩處理；

d)將振蕩處理后的角膜置于等滲液中進行超聲處理，以脫除細胞；

e)將脫細胞后的角膜放入軟化液中靜置，再放入水中振蕩處理；所述軟化液具有促進角膜膠原微觀結構恢復的作用。

在本發明非限制性的實施方式中，所述預定厚度為200-500μm，本領域技術人員也可根據后續處理要求及臨床使用需求確定板層角膜的厚度。申請人經過大量試驗總結認為，當厚度為200-500μm時，既便于后續處理，又使制成的角膜能夠滿足臨床使用需求。