[發(fā)明專利]一種腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911065992.5
• 申請(qǐng)日: 2019-11-04
• 公開（公告）號(hào): CN112760286B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹申意;張函槊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京基石生命科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

1.一種培養(yǎng)腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞的方法，包括如下步驟：利用腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞；

所述腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)基由抗菌抗真菌劑三抗、HEPES、GlutaMax、人重組蛋白bFGF、人重組蛋白HGF、人重組蛋白MSP、人重組蛋白VEGF、人重組蛋白GDNF、A83-01、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-2 Supplement、SB431542、Y-27632、CHIR99021和Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基組成；其中，所述抗菌抗真菌劑三抗中的青霉素的終濃度為100-200U/mL；所述抗菌抗真菌劑三抗中的鏈霉素的終濃度為100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌劑三抗中的兩性霉素 B的終濃度為250ng/mL；所述HEPES的終濃度為8-12mM；所述GlutaMax的終濃度為0.8-1.2%體積百分含量；所述人重組蛋白bFGF的終濃度為30 ng/mL；所述人重組蛋白HGF的終濃度為20ng/mL；所述人重組蛋白MSP的終濃度為20ng/mL；所述人重組蛋白VEGF的終濃度為40 ng/mL；所述人重組蛋白GDNF的終濃度為100 ng/mL；所述A83-01的終濃度為1μM；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的終濃度為1mM；所述N-2 Supplement的終濃度為1%體積百分含量；所述SB431542的終濃度為2μM；所述Y-27632的終濃度為10 μM；所述CHIR99021的終濃度為4μM；余量均為Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞是用樣本解離液對(duì)腦腫瘤實(shí)體瘤組織進(jìn)行解離處理后獲得的；

所述樣本解離液由膠原酶I、膠原酶IV和PBS組成；其中，所述膠原酶I在所述樣本解離液中的終濃度為150-250 U/mL；所述膠原酶IV在所述樣本解離液中的終濃度為150-250 U/mL；余量均為PBS。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：是按照包括如下步驟的方法用所述樣本解離液對(duì)所述腦腫瘤實(shí)體瘤組織進(jìn)行解離的：按0.1-0.3 mL所述樣本解離液每mg組織的用量，將剪碎后的所述腦腫瘤實(shí)體瘤組織用事先37 ℃預(yù)熱的所述樣本解離液進(jìn)行處理，在37℃條件下進(jìn)行樣本解離，解離時(shí)間15分鐘至3小時(shí)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，是按照包括如下步驟的方法用所述腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)所述腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞的：使用細(xì)胞培養(yǎng)容器M，利用所述腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)所述腦腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞，37℃，5% CO₂條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每2-4天更換一次培養(yǎng)基；

所述細(xì)胞培養(yǎng)容器M為如下任一：（I）聚苯乙烯材質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)容器、聚碳酸酯材質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)容器、聚甲基丙烯酸甲酯材質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)容器、COC樹脂材質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)容器或環(huán)烯烴聚合物材質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)容器；（II）對(duì)（I）中的細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行CYTOP修飾后的細(xì)胞培養(yǎng)容器。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述細(xì)胞培養(yǎng)容器為細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)孔板或用于細(xì)胞培養(yǎng)的微孔板芯片。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述（II）中，是按照包括如下步驟的方法對(duì)所述（I）中的細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行CYTOP修飾的：對(duì)所述（I）中的細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行純氧刻蝕，刻蝕條件為功率20W，刻蝕時(shí)間為3分鐘；然后用1% CYTOP溶液覆蓋所述細(xì)胞培養(yǎng)容器表面，晾干所述1% CYTOP溶液即完成CYTOP修飾。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述1% CYTOP溶液的組成如下：每100mL所述1% CYTOP溶液中含有1mL CYTOP，余量為氟油。