[發明專利]一種泌尿腫瘤實體瘤原代細胞的培養方法

在審

• 申請號: 201911065991.0
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN112760285A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 尹申意;張函槊
• 申請（專利權）人: 北京基石生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

1.一種培養泌尿腫瘤實體瘤原代細胞的方法，包括如下步驟：利用泌尿腫瘤實體瘤原代細胞培養基懸浮培養泌尿腫瘤實體瘤原代細胞；

所述泌尿腫瘤實體瘤原代細胞培養基由抗菌抗真菌劑三抗、HEPES、GlutaMax、人重組蛋白EGF、人重組蛋白bFGF、人重組蛋白HGF、人重組蛋白MSP、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-2Supplement、Y-27632、雙氫睪酮、前列腺素E2和Advanced DMEM/F12培養基組成；其中，所述抗菌抗真菌劑三抗中的青霉素的終濃度為100-200U/mL；所述抗菌抗真菌劑三抗中的鏈霉素的終濃度為100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌劑三抗中的兩性霉素B的終濃度為250-250ng/mL；所述HEPES的終濃度為8-12mM；所述GlutaMax的終濃度為0.8-1.2％(體積百分含量)；所述人重組蛋白EGF的終濃度為10-100ng/mL；所述人重組蛋白bFGF的終濃度為10-50ng/mL；所述人重組蛋白HGF的終濃度為5-25ng/mL；所述人重組蛋白MSP的終濃度為5-25ng/mL；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的終濃度為0.5-2mM；所述N-2Supplement的終濃度為1％(體積百分含量)；所述Y-27632的終濃度為5-20μM；所述雙氫睪酮的終濃度為1-10nM；所述前列腺素E2的終濃度為1-10μM；余量均為Advanced DMEM/F12培養基。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述泌尿腫瘤實體瘤原代細胞是用樣本解離液對泌尿腫瘤實體瘤組織進行解離處理后獲得的；

所述樣本解離液由膠原酶I、膠原酶II、膠原酶IV和PBS組成；其中，所述膠原酶I在所述樣本解離液中的終濃度為150-250U/mL；所述膠原酶II在所述樣本解離液中的終濃度為150-250U/mL；所述膠原酶IV在所述樣本解離液中的終濃度為150-250U/mL；余量均為PBS；

進一步地，是按照包括如下步驟的方法用所述樣本解離液對所述泌尿腫瘤實體瘤組織進行解離的：按0.1-0.3mL所述樣本解離液每mg組織的用量，將剪碎后的所述泌尿腫瘤實體瘤組織用事先37℃預熱的所述樣本解離液進行處理，在37℃條件下進行樣本解離，解離時間15分鐘至3小時。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，是按照包括如下步驟的方法用所述泌尿腫瘤實體瘤原代細胞培養基懸浮培養所述泌尿腫瘤實體瘤原代細胞的：使用細胞培養容器M，利用所述泌尿腫瘤實體瘤原代細胞培養基懸浮培養所述泌尿腫瘤實體瘤原代細胞，37℃，5％CO₂條件下進行培養，每2-4天更換一次培養基；

所述細胞培養容器M為如下任一：(I)聚苯乙烯材質的細胞培養容器、聚碳酸酯材質的細胞培養容器、聚甲基丙烯酸甲酯材質的細胞培養容器、COC樹脂材質的細胞培養容器、環烯烴聚合物材質的細胞培養容器或低吸附表面的細胞培養容器；(II)對(I)中的細胞培養容器進行CYTOP修飾后的細胞培養容器；

進一步地，所述細胞培養容器為細胞培養皿、細胞培養孔板或用于細胞培養的微孔板芯片；

進一步地，所述(II)中，是按照包括如下步驟的方法對所述(I)中的細胞培養容器進行CYTOP修飾的：對所述(I)中的細胞培養容器進行純氧刻蝕，刻蝕條件為功率20W，刻蝕時間為3分鐘；然后用1％CYTOP溶液覆蓋所述細胞培養容器表面，晾干所述1％CYTOP溶液即完成CYTOP修飾；

更進一步地，所述1％CYTOP溶液的組成如下：每100mL所述1％CYTOP溶液中含有1mLCYTOP，余量為氟油。

4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，還包括如下對所述泌尿腫瘤實體瘤組織進行解離前處理的步驟：用體積百分含量為70-75％的乙醇清洗泌尿腫瘤實體瘤組織樣本表面；用樣本清洗液和無菌的PBS溶液先后清洗所述泌尿腫瘤實體瘤組織樣本；

具體的，所述樣本清洗液由雙抗P/S和PBS組成；其中，所述雙抗P/S中的青霉素的終濃度為100-200U/mL；所述雙抗P/S中的鏈霉素的終濃度為100-200μg/mL；余量均為PBS。