[發明專利]一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法

在審

• 申請號: 201911065359.6
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110863030A
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發明（設計）人: 于振洋;艾芳婷;尹大強;孟祥周
• 申請（專利權）人: 同濟大學;嘉興同濟環境研究院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 余瑩

本發明提供了一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法，屬于生態風險評價領域，本發明以24孔細胞培養板作為主要暴露環境，配制有特定坡度的NGM培養基，在其一側對秀麗隱桿線蟲卵進行受試物質暴露，利用秀麗隱桿線蟲從蟲卵到成蟲的發育階段對外界環境變化的敏感性，在另一側采用大腸桿菌食物誘導線蟲產生運動行為，根據該發育與運動的特征進行發育毒性的檢測，甚至不需要顯微鏡的輔助即可直接觀察，采用肉眼直接觀察食物側線蟲的有無及多少，即可快速、定性判斷受試物質的發育毒性，從暴露至指標檢測的用時在24h左右，縮短了指標檢測時間，并集肉眼觀測與顯微觀測于一體，檢測結果具有較高的準確性和可靠性。

技術領域

本發明涉及生態風險評價領域，具體涉及一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法。

背景技術

隨著人類科技的進步和生活質量的不斷提高，越來越多的化學品用于人們的生活，伴隨而來是大量進入環境中的化學品在不斷地遷移、轉化，通過各種途徑最終可能重新流入水體、土壤、大氣環境中，并可能隨著食物鏈逐步累積，最終對人類產生健康危害、對生態系統的穩定產生干擾。因此，對化學品的毒性檢測是評估其健康風險、環境危害的重要手段。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)，具有精確而短暫的生命周期、體積小、容易培養等諸多優點，以細菌為食、非寄生，對人、動植物沒有危害，安全性高。秀麗隱桿線蟲對外界環境的變化非常敏感，在環境脅迫下秀麗隱桿線蟲會改變它們的生長發育、運動能力等生物指標。

目前化學品的毒性檢測多采用急性致死毒性指標，該方法通常采用高濃度、急性暴露的實驗條件，與實際環境低濃度、慢性暴露的實際情況不符，檢測準確度相對不高，因此低濃度條件下的生長發育等毒性效應的環境意義日漸凸顯，同時傳統的方法中進行后續的指標檢測時還需將其進行轉移，從暴露開始、到轉移操作以及后續指標檢測耗費的時間通常在36h左右，其發育毒性生物檢測方法都存在檢測周期長等缺點，難以高效的推廣。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本申請提供了一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法。本發明檢測周期短、接近實際環境暴露情況，集肉眼觀測與顯微觀測于一體，檢測結果具有較高的準確性和可靠性。

本發明的技術方案如下：

一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法，該方法包括如下步驟：

a.制備菌液：利用培養基培養尿嘧啶缺陷型大腸桿菌，獲得菌體后與無菌鉀溶液混合，得到特定濃度的菌液；

b.制備秀麗隱桿線蟲卵液：采用同步化方法制備秀麗隱桿線蟲卵，向秀麗隱桿線蟲卵中加入無菌鉀溶液稀釋，得到特定濃度的卵液；

c.制備培養基：采用24孔細胞培養板制備培養基并使24孔細胞培養板與水平面的夾角呈12°-15°放置，以此形成24孔細胞培養板中孔底面的傾斜狀態，向24孔細胞培養板的各孔中加入液態NGM培養基，待液態NGM培養基冷凝后，得到具有坡度的多個固態NGM培養基；將24孔細胞培養板與水平面的夾角呈18°-20°放置，在各固態NGM培養基的最高處滴加步驟a得到的菌液，保持24孔細胞培養板的角度不變將其置于培養箱內放置12-24h，之后取出24孔細胞培養板，對菌液中的尿嘧啶缺陷型大腸桿菌進行滅活處理；

d.分組：將步驟c中的24孔細胞培養板水平放置，在各固態NGM培養基的最低處滴加步驟b制備的秀麗隱桿線蟲卵液，以24孔細胞培養板每一列中的全部固態NGM培養基作為一組，選取其中一組作為空白對照組，其余五組作為暴露組；

e.配制受試物溶液：采用無菌鉀溶液稀釋受試物質得到受試物溶液，對應每個暴露組均配制一份受試物溶液；