[發明專利]一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法

在審

• 申請號: 201911065359.6
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN110863030A
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發明（設計）人: 于振洋;艾芳婷;尹大強;孟祥周
• 申請（專利權）人: 同濟大學;嘉興同濟環境研究院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 余瑩

1.一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

a.制備菌液：利用培養基培養尿嘧啶缺陷型大腸桿菌，獲得菌體后與無菌鉀溶液混合，得到特定濃度的菌液；

b.制備秀麗隱桿線蟲卵液：采用同步化方法制備秀麗隱桿線蟲卵，向秀麗隱桿線蟲卵中加入無菌鉀溶液稀釋，得到特定濃度的卵液；

c.制備培養基：采用24孔細胞培養板制備培養基并使24孔細胞培養板與水平面的夾角呈12°-15°放置，以此形成24孔細胞培養板中孔底面的傾斜狀態，向24孔細胞培養板的各孔中加入液態NGM培養基，待液態NGM培養基冷凝后，得到具有坡度的多個固態NGM培養基；將24孔細胞培養板與水平面的夾角呈18°-20°放置，在各固態NGM培養基的最高處滴加步驟a得到的菌液，保持24孔細胞培養板的角度不變將其置于培養箱內放置12-24h，之后取出24孔細胞培養板，對菌液中的尿嘧啶缺陷型大腸桿菌進行滅活處理；

d.分組：將步驟c中的24孔細胞培養板水平放置，在各固態NGM培養基的最低處滴加步驟b制備的秀麗隱桿線蟲卵液，以24孔細胞培養板每一列中的全部固態NGM培養基作為一組，選取其中一組作為空白對照組，其余五組作為暴露組；

e.配制受試物溶液：采用無菌鉀溶液稀釋受試物質得到受試物溶液，對應每個暴露組均配制一份受試物溶液；

f.觀察計算：向各暴露組內秀麗隱桿線蟲卵液處滴入與之對應濃度的受試物溶液，向空白對照組內滴入同一濃度的無菌K-溶液，在20℃條件下暴露2小時后，將24孔細胞培養板置于生物潔凈臺上開蓋吹15-20min，蒸發多余水分，之后將24孔細胞培養板置于20℃條件下培養，22h后使用肉眼或顯微鏡觀察秀麗隱桿線蟲運動至步驟c中固態NGM培養基上滴加菌液位置的數量，計算該處線蟲數量與線蟲總數之比，得到線蟲通過率；

g.數值比較：將秀麗隱桿線蟲的通過率數據作為縱坐標及受試物溶液濃度數據作為橫坐標進行線性擬合，獲得y＝ax+k形式的擬合方程式中a及k的數值，其中，x是受試物溶液濃度，y是秀麗隱桿線蟲通過率，k是常數，a是系數，利用擬合方程式計算秀麗隱桿線蟲通過率為50％：y＝0.5時受試物溶液濃度的數值，記為半數效應濃度：EC50，基于此EC50數值，比較不同受試物質的發育毒性強弱，EC50數值越低，發育毒性越強。

2.根據權利要求1所述的一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法，所述步驟a中，向菌液中逐次加入2mL無菌鉀溶液稀釋，直至菌液中細菌總量為10⁹至10¹⁰個/mL。

3.根據權利要求1所述的一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法，所述步驟b中，向秀麗隱桿線蟲卵中逐次加入2mL無菌鉀溶液稀釋，直至秀麗隱桿線蟲卵液所含秀麗隱桿線蟲得濃度為10-12枚/μL。

4.根據權利要求1所述的一種利用秀麗隱桿線蟲檢測發育毒性的方法，所述步驟f中先用無菌吸水紙在孔板最深處吸取固態NGM培養基上的多余水分，再將其置于生物潔凈臺上。