[發明專利]一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法

在審

• 申請號: 201911063921.1
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN111378722A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 陳全勝;劉蕊;呂鵬;李歡歡;黃棟;賀培歡;張運蓮
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種基于CRISPR?Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法：以生物樣品中特異性核酸片段為研究對象，制備生物樣品的核酸靶標、猝滅熒光探針、Cas12g三元復合體；將Cas12g三元復合體、核酸靶標、猝滅熒光探針、背景RNA和RNA酶抑制劑混合在核酸酶緩沖液中孵育，當Cas12g三元復合體與核酸靶標識別匹配后，不僅剪切核酸靶標，且附帶非特異性反式剪切猝滅熒光探針，進而獲取可被檢測的熒光；通過采集熒光光譜數據，構建上轉換納米熒光強度變化值與不同濃度的核酸靶標的定量檢測模型，實現生物樣品中核酸靶標的納米熒光痕量快速檢測。本發明能夠適用于生物樣品中特異性核酸片段快速、特異、靈敏的檢測方法。

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，尤其是一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法。

背景技術

伴隨著核酸檢測技術的快速發展，各種生物樣品的快速檢測方法相繼出現。如致使食源性疾病的食源性致病菌，已成為世界食品安全的熱點問題。近年來，國內外的生物恐怖主義威脅以及食源性疾病事件引發人們對食源性致病菌的高度關注。對生物樣品中食源性致病菌特異性核酸片段的快速檢測是預防食源性疾病的重要手段。

目前，核酸檢測技術包括基于PCR的檢測技術(普通PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR和實時定量反轉錄PCR等)和非PCR核酸檢測技術(環介導等溫擴增、核酸依賴性擴增檢測技術、基因芯片和微流體芯片等)。這些檢測方法雖各有優勢，但存在檢測周期長或檢測費用高或易出現假陽性和假陰性結果等缺陷。因此，迫切需要一種快速、特異、靈敏的適用于生物樣品中特異性核酸片段的檢測方法。國內外尚未有采用CRISPR-Cas12g系統實現生物樣品中特異性核酸片段的納米熒光定量檢測方面的報道。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提出了一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法，能夠適用于生物樣品中特異性核酸片段快速、特異、靈敏的檢測方法。

本發明所采用的技術方案如下：

一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法：

以生物樣品中特異性核酸片段為研究對象，制備生物樣品的核酸靶標、猝滅熒光探針、Cas12g三元復合體；將Cas12g三元復合體、核酸靶標、猝滅熒光探針、背景RNA和RNA酶抑制劑混合在核酸酶緩沖液中孵育，當Cas12g三元復合體與核酸靶標識別匹配后，不僅剪切核酸靶標，且附帶非特異性反式剪切猝滅熒光探針，進而獲取可被檢測的熒光；通過采集熒光光譜數據，構建上轉換納米熒光強度變化值與不同濃度的核酸靶標(生物樣品特異性核酸片段)的定量檢測模型，實現生物樣品中核酸靶標(特異性核酸片段)的納米熒光痕量快速檢測。

進一步，所述核酸靶標的制備方法為：若生物樣品為DNA則提取方法為：經過RPA擴增和體外轉錄可獲得靶標；若生物樣品為RNA則提取方法為：經過RT-RPA擴增和體外轉錄進而得到靶標；

進一步，所述猝滅熒光探針的熒光基團采用上轉換納米顆粒(UCNP_S)，猝滅基團使用水溶性非熒光猝滅劑QC-1，該淬滅劑能夠將一定距離內熒光基團發出的光吸收，擁有較寬的吸收光譜范圍(～500nm到～900nm),猝滅效率高(97％)；所述熒光基團和猝滅基團之間用單鏈DNA或RNA連接，最終得到猝滅熒光探針QC-1-RNA/DNA-UCNP_S。所述猝滅熒光探針擁有信號報告功能，當猝滅熒光探針中的單鏈RNA或單鏈DNA被激活的Cas12g蛋白附帶切割時，其中的UCNP_S發出可被檢測的熒光。且上轉換納米顆粒(UCNP_S)的光化學性質穩定、基本不受外界環境影響、檢測背景低、裝置簡單以及成本低。