[發明專利]一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法

在審

• 申請號: 201911063921.1
• 申請日: 2019-11-04
• 公開（公告）號: CN111378722A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 陳全勝;劉蕊;呂鵬;李歡歡;黃棟;賀培歡;張運蓮
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法，其特征在于，以生物樣品中特異性核酸片段為研究對象，制備生物樣品的核酸靶標、猝滅熒光探針、Cas12g三元復合體；將Cas12g三元復合體、核酸靶標、猝滅熒光探針、背景RNA和RNA酶抑制劑混合在核酸酶緩沖液中孵育，當Cas12g三元復合體與核酸靶標識別匹配后，不僅剪切核酸靶標，且附帶非特異性反式剪切猝滅熒光探針，進而獲取可被檢測的熒光；通過采集熒光光譜數據，構建上轉換納米熒光強度變化值與不同濃度的核酸靶標的定量檢測模型，實現生物樣品中核酸靶標的納米熒光痕量快速檢測。

2.根據權利要求1所述的一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法，其特征在于，所述核酸靶標的制備方法為：若生物樣品為DNA則提取方法為：經過RPA擴增和體外轉錄可獲得靶標；若生物樣品為RNA則提取方法為：經過RT-RPA擴增和體外轉錄進而得到靶標。

3.根據權利要求1或2所述的一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法，其特征在于，所述猝滅熒光探針的熒光基團采用上轉換納米顆粒UCNP_S，猝滅基團使用非熒光猝滅劑QC-1，所述熒光基團和猝滅基團之間用單鏈DNA或RNA連接，最終得到猝滅熒光探針QC-1-RNA/DNA-UCNP_S。

4.根據權利要求3所述的一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法，其特征在于，所述上轉換納米顆粒采用高溫熱分解法合成，過程為：以稀土結晶水合物氯化鹽等為原料，油酸和1-十八烯為溶劑，搭建基于稀土元素摻雜的高溫熱分解法UCNPs合成平臺，制備出粒徑大小約為50nm的油相OA-UCNPs，在其表面修飾氨基轉為水溶性的NH₂-UCNPs。

5.根據權利要求4所述的一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法，其特征在于，所述Cas12g三元復合體包括Cas12g、crRNA和tracrRNA，所述crRNA和tracrRNA可進行共折疊，crRNA的N區域為可變間隔序列區，且可變間隔序列區與核酸靶標序列互補。

6.根據權利要求5所述的一種基于CRISPR-Cas12g的特異性核酸片段納米熒光痕量快速檢測方法，其特征在于，所述Cas12g的制備方法：

S1，構建Cas12g蛋白表達質粒。合成Cas12g基因，在Cas12g基因序列兩端分別加上BamHI和Xho I酶切位點；用BamH I和Xho I雙酶切處理pET28a質粒；將加上BamH I和Xho I酶切位點的Cas12g與酶切后的pET28a質粒連接，得到Cas12g蛋白表達質粒，即pET28a-Cas12g；

S2，將Cas12g蛋白表達質粒轉化至感受態細胞，涂平板培養過夜，挑選單菌落擴大培養，待菌液OD600為1～1.5時，用0.2mM IPTG誘導蛋白表達，培養過夜后離心收集培養物，裂解緩沖液+蛋白酶抑制劑進行重懸；超聲破碎細胞，4℃條件下28000xg離心20min，將上清液加到HisTrap FF柱上，通過FPLC經50mM～500mM的咪唑梯度純化；SDS-PAGE凝膠電泳后再濃縮，透析獲得Cas12g蛋白。