[發(fā)明專(zhuān)利]基于重組中華烏塘鱧卵黃蛋白原在水體雌激素污染檢測(cè)方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911060062.0
• 申請(qǐng)日: 2019-11-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110726847B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周克夫;余鎰琦;孟坤;龍敏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廈門(mén)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/74
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/74;G01N33/68;C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 廈門(mén)南強(qiáng)之路專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森;戴深峻

1.中華烏塘鱧卵黃蛋白原的水體雌激素污染的檢測(cè)方法，其特征在于所述卵黃蛋白原為重組中華烏塘鱧卵黃蛋白原或中華烏塘鱧血液、肝臟提取獲得的卵黃蛋白原，檢測(cè)方法包括以下步驟：

（1）應(yīng)用基因工程原理克隆中華烏塘鱧卵黃蛋白原全長(zhǎng)基因，選擇其中一段819bp核苷酸序列進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，819bp核苷酸序列如SEQ NO 3所示，經(jīng)純化和濃縮獲得融合蛋白；

（2）制備中華烏塘鱧卵黃蛋白原多克隆抗體，包括以下步驟：

1）制備完全和不完全福氏佐劑，重組卵黃蛋白原溶液用PBS稀釋至卵黃蛋白原濃度為0.1mg/mL，加入等體積完全福氏佐劑，用1mL注射器充分乳化，制成完全福氏佐劑；抗原溶液等體積與不完全福氏佐劑充分乳化后制成不完全福氏佐劑，采用皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行注射；

2）注射佐劑前，先用卡介苗刺激BalB/C小鼠的腘窩和足掌，激活小鼠免疫功能，一周后開(kāi)始免疫完全福氏佐劑；

3）第一次采用重組中華烏塘鱧卵黃蛋白原融合蛋白完全福氏佐劑免疫BalB/C小鼠；間隔10天后采用不完全福氏佐劑免疫小鼠，共免疫4次；

4）最后一次免疫7天后尾部取血ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)，符合要求后部分小鼠眼眶取全血，靜止4小時(shí)后離心獲得抗血清，即小鼠抗中華烏塘鱧卵黃蛋白原多克隆抗體；

（3）檢測(cè)鑒定中華烏塘鱧卵黃蛋白原多克隆抗體，檢測(cè)鑒定包括斑點(diǎn)雜交、ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)和DOT-blotting方法鑒定多克隆抗體；

（4）多克隆抗體在卵黃蛋白原測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華烏塘鱧卵黃蛋白原的水體雌激素污染的檢測(cè)方法，其特征在于，在步驟（3）中所述ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)步驟包括：

1）向酶標(biāo)板凹孔中加入100 μL 卵黃蛋白原純化蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，在4℃條件下孵育16 h；

2）倒掉酶標(biāo)板凹孔中的殘余液體，晾干后每孔加入300 μL PBST-20，放置于搖床上振搖5 min，每次靜置5 min后倒去溶液，晾干，重復(fù)進(jìn)行3次；

3）向酶標(biāo)板凹孔中加入250 μL 5 %脫脂牛奶，用封口膜密封酶標(biāo)板，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中，在500 rpm條件下震蕩溫育1.5 h；

4）倒掉酶標(biāo)板凹孔中的殘余液體，每孔加入300 μL PBST-20，放置于搖床上振搖5min，每次靜置5 min后倒去溶液，晾干，重復(fù)進(jìn)行3次；

5）向酶標(biāo)板凹孔中加入100 μL鼠抗卵黃蛋白原多克隆抗體，用封口膜密封酶標(biāo)板，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中，在500 rpm條件下震蕩溫育1.5 h；

6）倒掉酶標(biāo)板凹孔中的殘余液體，每孔加入300 μL PBST-20，放置于搖床上振搖5min，每次靜置5 min后倒去溶液，晾干，重復(fù)進(jìn)行3次；

7）向酶標(biāo)板凹孔中加入100 μL按1︰2000比例稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，用封口膜密封酶標(biāo)板，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中，在500 rpm條件下震蕩溫育1.5 h；

8）倒掉酶標(biāo)板凹孔中的殘余液體，每孔加入300 μL PBST-20，放置于搖床上振搖5min，每次靜置5 min后倒去溶液，晾干，重復(fù)進(jìn)行3次；

9）將酶標(biāo)板移入光線(xiàn)較弱的條件下，每孔中加入顯色液100 μL，以封口膜密封酶標(biāo)板，而后將酶標(biāo)板以鋁箔層層包裹，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱中在溫37℃、500 rpm條件下震蕩溫育45 min，取出后向孔內(nèi)加入50 μL 0.5M硫酸，使反應(yīng)停止；將板置于酶標(biāo)儀下，于波長(zhǎng)450nm處讀取數(shù)據(jù)，計(jì)算卵黃蛋白原含量，獲得小鼠抗卵黃蛋白原抗體與抗體稀釋度的量效關(guān)系。