[發(fā)明專利]通過檢測SNP位點確定等位基因的基因型的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911059265.8
• 申請日: 2019-11-01
• 公開（公告）號: CN110607364B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王建勛;李逸豪;石冰潔;馮婭茹;王萍;王君
• 申請（專利權(quán)）人: 北京中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京漢鼎理利專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11618
• 代理人: 潘滿根

本發(fā)明提供一種通過檢測SNP位點確定等位基因的基因型的方法，所述方法通過AS?PCR法檢測待測等位基因的一個或多個SNP位點，然后根據(jù)每個SNP位點的檢測結(jié)果，確定每個待測等位基因的基因型。本發(fā)明方法不需要昂貴的檢測儀器，可以在小型實驗室和醫(yī)院的檢驗室中進行，很符合臨床檢驗靈敏度高、方便快捷的要求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種通過檢測SNP位點確定等位基因的基因型的方法。

背景技術(shù)

等位基因是指位于一對同源染色體相同位置上控制同一性狀不同形態(tài)的基因，英文原文為allele。不同的等位基因產(chǎn)生例如發(fā)色或血型等遺傳特征的變化。等位基因控制相對性狀的顯隱性關(guān)系及遺傳效應(yīng)，可將等位基因區(qū)分為不同的類別。在個體中，等位基因的某個形式(顯性的)可以比其他形式(隱性的)表達得多。當一個生物體帶有一對完全相同的等位基因時，則該生物體就該基因而言是純合的(homozygous)或可稱純種(true-breeding)；反之，如果一對等位基因不相同，則該生物體是雜合的(heterozygous)或可稱雜種(hybrid)。等位基因各自編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物，決定某一性狀，并可因突變而失去功能。等位基因之間存在相互作用。當一個等位基因決定生物性狀的作用強于另一等位基因并使生物只表現(xiàn)出其自身的性狀時，就出現(xiàn)了顯隱性關(guān)系。作用強的是顯性，作用被掩蓋而不能表現(xiàn)的為隱性。

單核苷酸多態(tài)性(Single?Nucleotide?Polymorphism,SNP)是一種遺傳標記，位于人類基因組上。隨著人類基因組計劃的完成，人們發(fā)現(xiàn)人類的DNA序列并非完全一致的，其中包含著某些變異。這些變異導(dǎo)致了多種遺傳性疾病的產(chǎn)生。作為第三代遺傳標志，SNP位點與遺傳性疾病的產(chǎn)生息息相關(guān)。故對SNP位點進行研究及檢測，將為發(fā)現(xiàn)遺傳疾病高危群體、檢測疾病的相關(guān)基因以及對生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究等方面提供一條新的出路。現(xiàn)有的SNP的檢測方法大致可以分為兩大類：一大類是以單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異性PCR(allele-specific?PCR，AS-PCR)等為代表的以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法。另一大類是以直接測序、質(zhì)譜檢測技術(shù)等為代表的高通量、自動化程度較高的檢測方法。多種檢測方法中直接測序法準確度最高，常作為SNP位點檢測的金標準。但該方法所需儀器成本高，測序耗時較長，很難在一般性醫(yī)院或?qū)嶒炇抑衅占啊?/p>

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種通過檢測SNP位點確定等位基因的基因型的方法，所述方法通過AS-PCR法檢測待測等位基因的一個或多個SNP位點，然后根據(jù)每個SNP位點的檢測結(jié)果，確定每個待測等位基因的基因型。

在一種實施方式中，所述方法包括以下步驟：步驟1：針對待測等位基因的每個SNP位點設(shè)計三條擴增引物，其中一條擴增引物是上游引物或下游擴增引物，相應(yīng)地另外二條擴增引物是下游擴增引物或上游擴增引物；所述二條擴增引物3’末端堿基與SNP位點堿基分別是相同和互補，所述二條擴增引物的其它各個位置堿基相同；步驟2：構(gòu)建符合所述SNP位點所有可能基因型的陽性質(zhì)粒對照組，根據(jù)陽性對照組QPCR結(jié)果得到各待測SNP位點基因型判讀區(qū)間；和，步驟3：使用步驟1設(shè)計的特異性擴增引物對待測樣本進行QPCR反應(yīng)，所得結(jié)果根據(jù)步驟2確定的SNP位點不同基因型判讀區(qū)間判別待測樣本SNP位點的基因型。

在一種實施方式中，所述步驟2包括以下步驟：a.對所述SNP位點所有可能出現(xiàn)的基因型與引物組合設(shè)計至少三個不同梯度DNA陽性模板實驗組，每個SNP位點有三種基因型，每種基因型依照步驟1的方法設(shè)計三條擴增引物，每個SNP位點共有六種不同的基因型和引物組合，然后以上述組合進行QPCR反應(yīng)；b.引物與所對應(yīng)的純合基因型質(zhì)粒模板為特異性組，引物與非對應(yīng)的純合基因型質(zhì)粒模板為非特異性組，引物與混合基因型質(zhì)粒模板為混合組；c.將特異性組、非特異性組和混合組的QPCR結(jié)果換算成基因拷貝數(shù)后，按純合基因型/純合基因型、雜合基因型/雜合基因型比較各基因拷貝數(shù)，分別得到各基因型各濃度梯度下特異性組合與非特異性組合、混合組組合比較的倍率比；d.將所得各種基因型的倍率比按對數(shù)形式表現(xiàn)出來，并繪制所述SNP位點基因型定量分型區(qū)域圖，得到各待測SNP位點基因型判讀區(qū)間。