[發明專利]通過檢測SNP位點確定等位基因的基因型的方法

有效

• 申請號: 201911059265.8
• 申請日: 2019-11-01
• 公開（公告）號: CN110607364B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 王建勛;李逸豪;石冰潔;馮婭茹;王萍;王君
• 申請（專利權）人: 北京中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京漢鼎理利專利代理事務所(特殊普通合伙) 11618
• 代理人: 潘滿根

1.通過檢測SNP位點確定等位基因的基因型的方法，其特征在于，所述方法通過AS-PCR法檢測待測等位基因的一個或多個SNP位點，然后根據每個SNP位點的檢測結果，確定每個待測等位基因的基因型；

所述方法包括以下步驟：

步驟1：針對待測等位基因的每個SNP位點設計三條擴增引物，其中一條擴增引物是上游引物或下游擴增引物，相應地另外二條擴增引物是下游擴增引物或上游擴增引物；所述二條擴增引物3’末端堿基與SNP位點堿基分別是相同和互補，所述二條擴增引物的其它各個位置堿基相同；

步驟2：構建符合所述SNP位點所有可能基因型的陽性質粒對照組，根據陽性對照組QPCR結果得到各待測SNP位點基因型判讀區間；

步驟3：使用步驟1設計的特異性擴增引物對待測樣本進行QPCR實驗，所得結果根據步驟2確定的SNP位點不同基因型判讀區間判別待測樣本SNP位點的基因型；

所述步驟2包括以下步驟：

a.對所述SNP位點所有可能出現的基因型與引物組合設計至少三個不同梯度DNA陽性模板實驗組，每個SNP位點有三種基因型，每種基因型依照步驟1的方法設計三條擴增引物，每個SNP位點共有六種不同的基因型和引物組合，然后以上述組合進行QPCR實驗；

b.引物與所對應的純合基因型質粒模板為特異性組，引物與非對應的純合基因型質粒模板為非特異性組，引物與混合基因型質粒模板為混合組；

c.QPCR反應結束后，以ct值為橫坐標，特異性引物與相對應的純合子基因型組起始拷貝數濃度的對數為縱坐標，繪制定量標準曲線；將非特異性組和混合組的QPCR結果換算成基因拷貝數后，按純合基因型/純合基因型、雜合基因型/雜合基因型比較各基因拷貝數，分別得到各基因型各濃度梯度下特異性組合與非特異性組合、混合組組合比較的倍率比；

d.將所得各種基因型的倍率比按對數形式表現出來，并繪制所述SNP位點基因型定量分型區域圖，得到各待測SNP位點基因型判讀區間；

所述待測等位基因是聚集素基因，所述SNP位點是rs11136000、rs2279590和/或rs9331888；

所述rs11136000位點在步驟1中三條擴增引物分別是：上游引物SEQ?No.3：5’-TAAAGAATCCACTCATCCTTCAAGA-3’，下游引物SEQ?No.4：5’-GCAAGGGCCCGTTAGAGAA-3’和SEQNo.5：5’-GCAAGGGCCCGTTAGAGAG-3’；

所述rs2279590位點在步驟1中三條擴增引物分別是：上游引物SEQ?No.8：5’-GGAAGTCCTCCTGCTT-3’，上游引物SEQ?No.9：5’-GGAAGTCCTCCTGCTC-3’和下游引物SEQNo.10：5’-TGGAAACCACTTTTATTC-3’；

所述rs9331888位點在步驟1中三條擴增引物分別是：上游引物SEQ?No.13：5’-GGAAGTCCTCCTGCTT-3’，上游引物SEQ?No.14：5’-GGAAGTCCTCCTGCTC-3’和下游引物SEQNo.15：5’-TGGAAACCACTTTTATTC-3’。