[發明專利]煙曲霉的實時熒光RPA檢測試劑盒及其專用引物和探針

有效

• 申請號: 201911055768.8
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號: CN110760605B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 田曙光;韓黎;陳芳艷;蘇雪婷;胡穎嵩;陳勇;趙靜雅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/68
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 劉娜

本發明涉及煙曲霉的實時熒光RPA檢測試劑盒及其專用引物和探針，具體地，本發明提出了用于RPA檢測的引物組合物，該引物組合物包括：正向引物，所述正向引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；反向引物，所述反向引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。利用該RPA檢測的引物組合物可以在等溫條件下快速、方便、高效、特異且靈敏地檢測出出菌體、痰、血液、支氣管肺泡灌洗液等待測樣品中的煙曲霉成分。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體地，本發明涉及煙曲霉的實時熒光RPA檢測試劑盒及其專用引物和探針。

背景技術

煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是一種常見的機會致病菌，在環境中分布廣泛，其孢子被免疫缺陷或免疫低下病人吸入后極易引發侵襲性曲霉病，由于其致病機理尚不清楚，缺乏有效的治療方法，致死率高達90％。引起侵襲性曲霉病的主要真菌是煙曲霉，一般病人只有到了患病晚期或死亡后才能檢測出煙曲霉感染，因此，對煙曲霉進行早期診斷和預防至關重要。在過去的幾十年里，隨著高強度的免疫抑制治療、廣譜抗生素的廣泛使用，導致患者體內正常菌群失調以及屏障功能被破壞，從而引起真菌移位、定植以及感染等，煙曲霉感染患者的數量也不斷上升。國內外學者及臨床專家普遍認為，對煙曲霉進行早期診斷并加以及時治療是預防侵襲性曲霉病相對有效的方法。因此，建立一種特異性高、準確、靈敏、快速、方便、成本低廉的煙曲霉檢測方法是降低侵襲性曲霉病發生和危害的重要途徑。

現有的煙曲霉檢測方法主要為鏡檢和培養法，鏡檢法檢出率很低；而傳統培養鑒定方法需要對患者樣本先進行48小時以上培養，然后對菌落和微觀形態進行直接觀察[Nouer SA,Nucci M,Kumar NS,Grazziutti M,Barlogie B,Anaissie E.Earlierresponse assessment in invasive aspergillosis based on the kinetics of serumAspergillus galactomannan:proposal for a new definition.Clin Infect Dis.2011,53:671-676.]。傳統的培養鑒定方法雖然簡單、成本低，但耗時太長，靈敏度和特異度都很低，遠不能滿足臨床上對煙曲霉進行快速準確檢測的需要。目前，煙曲霉的檢測方法除了傳統的培養鑒定方法外，還有血清學檢測方法和分子生物學檢測方法。血清學檢測方法主要是檢測半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖，這兩種物質都是煙曲霉細胞壁的組成成分，當煙曲霉菌絲在肺組織中生長時這兩種物質就會釋放到血液中。但是，由于病人自身的免疫低下以及進行過抗真菌治療，用血清學檢測方法可能會產生假陰性或假陽性的結果[SuLahian A,Touratier S,Ribaud P.False positive test for aspergillusantigenemia related to concomitant administration of piperacillin andtazobactam.N Engl J Med.2003,349:2366-2367.]。分子生物學檢測方法主要是通過PCR技術(包括熒光定量PCR)對煙曲霉的特異性基因進行檢測，PCR技術具有特異性高、準確、靈敏、快速等優點，但是PCR技術對實驗人員及環境的要求很高，儀器設備昂貴，同時需要進行嚴格的溫度控制，很難應用于煙曲霉的臨床檢測[Ostrosky-Zeichner L.Invasivemycoses:diagnostic challenges.Am J Med.2012,125:S14-24.]。

因此，特異性高、準確、靈敏、快速、方便、成本低廉的煙曲霉檢測方法還有待進一步研究。

發明內容

本申請是基于發明人對以下事實和問題的發現和認識作出的：